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1、2023循环肿瘤DNA检测在结直肠癌诊治中的应用与进展摘要结直肠癌的发病率与病死率均位居恶性肿瘤的前列，早期诊断难度较大和术后复发等问题始终困扰着临床工作者。随着精准医学时代的到来，以循环肿瘤DNA(CtDNA)为代表的液体活检技术在肠癌早期筛查与诊断、术后微小残留病灶检测、辅助治疗的疗效和耐药监测等领域均取得了较多进步。本文总结了CtDNA检测技术在结直肠癌诊疗中的研究进展，并对其未来发展方向加以展望。结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率居于所有恶性肿瘤第二位,死亡率居于第四位,并且均呈现逐年上升的趋势川。据统计，2020年我国结直肠癌新发病例55.5万例，死亡病例高达28.6万例
2、2。不同临床分期的结直肠癌患者的预后和治疗效果差异较大。I期结直肠癌患者的5年生存率可以达到90%而IV期结直肠癌患者的5年生存率仅有14%3o因此，尽早发现和诊治是结直肠癌患者延长生存时间的关键。目前，肠镜检查、组织活检和影像学检查仍是临床上诊断和评估结直肠癌的主要手段，但这类方法存在一定局限性，如组织活检得到的分子病理信息易受标本异质性影响且组织活检有侵入性，难以多次重复取样等4。为了解决上述问题，研究人员提出了液体活检的概念。液体活检指的是以体液为检材来获得肿瘤生物信息的体外诊断技术。与传统组织活检相比，液体活检的优势在于可以降低肿瘤异质性的影响，且相较于组织而言，体液更易于获取，便于重
3、复取样和实时监测等5。液体活检的检材主要来源于血液、尿液及粪便等，其检测对象主要包括循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA,CtDNA循环肿瘤RNAs循环肿瘤细胞及肿瘤教化血小板等5,6。越来越多的临床研究已经证实液体活检技术有助于结直肠癌患者的早筛早诊、明确肿瘤分子病理特征、监测药物治疗疗效和评估术后微小残留病灶7,8,9。在诸多检测方法中,CtDNA检测技术开展较早，发展最为迅速，目前已有较多的循证医学证据证明其评估价值。因此，本文将重点总结CtDNA检测技术在结直肠癌诊治中的应用，为后续临床实践和研究提供借鉴与参考。一、CtDNA的生物学特征当人体细胞发生凋亡或坏死时，一
4、些片段化DNA会释放到体液中,称为游离DNAo游离DNA的来源较为复杂，有来自正常细胞的DNA,也有来自肿瘤细胞的DNA后者称为ctDNA10oHaber等11的研究证实，CtDNA所携带的遗传信息，能够客观反映出相应肿瘤组织的遗传变异，这为后续的临床研究提供了理论基础。也有观察性研究发现，患者血液CtDNA的动态变化与其治疗响应程度密切相关,如完成第一次药物治疗后外周血检测不到CtDNA的IV期患者其疾病进展风险仅有7%12。目前,CtDNA的检测内容主要包括遗传信息和浓度变化两个方面,其中遗传信息主要包括CtDNA携带的基因变异（点突变、插入与缺失突变等表观遗传变异和基因拷贝数变异等。Ct
5、DNA的浓度变化则主要与患者的肿瘤负荷以及临床分期相关。一项对640例不同类型的肿瘤患者（含64例结直肠癌患者）进行PCR技术检测的研究结果发现，IV期肿瘤患者的CtDNA检出率高达82%,而I期患者的检出率仅仅只有47%13z14o临床上，CtDNA的检材来源主要包括血液、粪便、腹腔积液等标本。不同检材来源的CtDNA有各自的优势，如伴有腹膜转移的结直肠癌患者的腹腔积液中的CtDNA检出率高于其血浆标本15o二、CtDNA检测用于结直肠癌的筛查与诊断在临床实践中,结直肠癌的早期筛查方法主要有粪便隐血实验和血液肿瘤标志物检测等，但这些方法的敏感度和特异度均较为有限。液体活检具有损伤较小、精准度
6、高的特性，CtDNA检测是新一代结直肠癌筛查方法的理想之选。正如上文所述,CtDNA的检出率与患者的肿瘤负荷显著相关，I期结直肠癌患者血液CtDNA的检出率不到50%14o为了解决I期结直肠癌患者CtDNA检出率较低的问题，研究人员应用了诸如微滴式数字PCR、二代测序（nextgenerationsequencingzNGS筹方法用于CtDNA的检测，极大地提高了CtDNA的检出率16。另外，由于DNA甲基化是结直肠癌发展过程中最早发生的表观遗传改变之一，研究人员也尝试探索CtDNA中特定基因的甲基化水平变化与结直肠癌发生之间的关系17o在2014年，Church等18尝试在结直肠癌患者和健康
7、人群中检测血浆CtDNA中的Septin9的甲基化，结果表明该位点对于结直肠癌患者的检测特异度高达91.5%o后续开展的多项前瞻性临床研究也证明了该甲基化位点对于结直肠癌的检测敏感度和特异度分别高达73%和94%而粪便隐血试验的检测敏感度只有58.8%19,20,但该位点在癌前病变和进展期腺瘤的检测上，敏感度仅为11.2%18.另外,在一项大样本前瞻性队列研究中，甲基化标志物cg10673833被证明具有较高的筛查和早期诊断肠癌的能力，该位点对于结直肠癌和癌前病变的诊断敏感度和特异度分别为89.7%和86.8%21o此外，多项观察性研究报道了BCAT1、IKZF1、IRF4和TMEM240等多
8、个甲基化位点也具有较高的诊断特异度22,23。目前，Septin9甲基化位点检测已经获得美国食品和药品监督管理局批准,可用于结直肠癌的筛查。但由于其对进展期腺瘤和I期结直肠癌的预测敏感度较低，该方法主要作为拒绝其他筛查方法的患者的筛查手段24。除了单一甲基化位点检测，国内多个研究团队在多基因多位点甲基化检测诊断结直肠癌领域中取得了显著进展，其中包括：丁春明教授团队检测Septin9基因的10个亚区域的甲基化25,徐瑞华教授团队检测9个甲基化标志物21,兰平教授团队检测11个甲基化标志物26,蔡国响和周平红教授团队检测6个甲基化标志物27,蔡国响教授团队检测191个基因的甲基化单倍型等28。这些
9、多位点甲基化模型均在早期诊断结直肠癌中展现出良好的准确性。三、基于CtDNA进行术后微小残留病灶检测在接受根治性手术切除和辅助治疗的11期和In期结直肠癌患者中仍有30%左右的患者会出现术后复发。目前临床上主要使用癌胚抗原作为常规随访检查项目，但癌胚抗原预测结直肠癌术后复发的敏感度仅40%左右。肿瘤微小残留病灶(minimalresidualdisease,MRD)指的是肿瘤患者经过治疗后，用影像学或肠镜等常规检查手段不能检测到，但是用分子生物学方法在体液中可以检测到的肿瘤细胞或特异度核酸分子,如CtDNA,从而提示残余病灶可能29。目前主要有两种技术用于检测CtDNA-MRD状态，分别是PC
10、R技术和NGS技术。PCR检测法主要利用基因变异序列进行检测，分析敏感度较高，但检测位点较少。而基于NGS的检测方法则又可分为肿瘤组织先验法(tumor-informedassays)和肿瘤组织未知分析法(tumoragnosticassays)29,30。肿瘤组织先验法需要对患者肿瘤组织进行测序，并进行基因突变监测，整体检测流程较为复杂，敏感度较高；而肿瘤组织未知分析法，仅仅需要患者的体液标本，可以缩短检测时间，但敏感度相对较低30。1 .CtDNA-MRD技术评估术后复发或转移风险Tie等31领衔前瞻性队列研究,运用CtDNA基因突变检测技术,发现在接受根治性切除的U期结直肠癌患者中，79
11、%的术后MRD阳性患者发生了复发。无独有偶，在11I期结直肠癌患者的临床试验中，术后MRD阳性的患者的无复发生存时间(relapse-freesurvivalzRFS)较短,53%术后MRD阳性的患者会在术后3年内复发。同样，化疗后MRD仍为阳性的患者的复发风险明显高于阴性患者32。此外，在接受新辅助放化疗的局部晚期直肠癌患者中,新辅助放化疗后或手术后MRD仍呈阳性者，其3年RFS为33%,而MRD阴性患者则为87%33o根据统计分析，患者术后CtDNA状态是独立的风险预测因素,其对于复发的预测能力高于其他临床病理因素34,35。多项运用不同技术路线的前瞻性研究也都证实了这些发现32,36,3
12、7。这些结果充分说明了术后MRD状态是强大高效的预测患者预后的生物学标志物。此外，研究人员还发现在CtDNA阳性的复发患者中，CtDNA阳性检出时间早于影像学检出复发时间,平均提前3至5个月左右37,38。2 .CtDNA-MRD技术指导术后辅助治疗根据临床病理的预后因素，11期结直肠癌可以分为低危型和高危型两个组别，目前临床上建议对高危型患者进行术后辅助化疗，从而减低术后复发风险，而低危型患者可以不用接受辅助治疗39。然而，传统的临床病理因素并不能完全准确地划分出高复发风险的患者。为了解决这一问题，研究人员尝试分析患者术后MRD状态与其辅助治疗获益情况的关系。一项针对II期结直肠癌患者的大型
13、随机对照试验-DYNAMlC研究的结果40表明，接受术后辅助治疗的MRD阳性患者的3年RFS可达86.4%,而术后MRD为阴性的患者即使不接受辅助治疗，其3年RFS仍高达92.5%0与此同时,IDEA-France研究以及国内蔡国响、王争教授发起的PostCA研究均显示，若术后CtDNA为阳性的高危In期患者只接受3个月术后辅助化疗，那么约有50%患者会在术后3年内复发37,41。此外，Kotani等35则通过比较11到IV期可切除结直肠癌患者化疗前后的CtDNA状态,发现CtDNA阳性的患者接受化疗后,CtDNA清除率可达70%,提示术后CtDNA阳性的患者可能从辅助治疗中获益。日本的CIR
14、CULATE-Japan研究检测了1563例1111I期患者术后4周的MRD状态，并持续动态监测这些患者的CtDNAo该研究结果显示术后4周MRD阳性的患者接受辅助治疗后的无疾病生存时间(disease-freesurvial,DFS)明显高于不接受辅助治疗的高风险患者，前者接受辅助治疗后的CtDNA清除率也明显更高，而术后4周MRD阴性的患者即使不进行药物治疗，其DFS并不会显著缩短42。同样,国内蔡国响教授团队则基于CtDNA甲基化qPCR测定法得出了类似的结论，即I11I期患者治疗后的MRD状态可以精确指导后续治疗决策37。综上所述，I11I期结直肠癌患者CtDNA的动态变化和MRD状态
15、对术后辅助治疗决策具有重要的参考价值，术后辅助化疗能够显著延长MRD阳性患者的RFS,而MRD阴性的患者并不能从辅助治疗中获益。目前，基于CtDNA的MRD监测已经纳入了2020年美国国立癌症研究所结直肠工作组白皮书和2023年中国抗癌协会临床肿瘤学协作专业委员会结直肠癌指南的辅助化疗章节中7,43。此外,多项基于CtDNA-MRD状态的干预性临床试验正在陆续开展，这些研究的结果可能进一步证明结直肠癌患者的MRD状态在术后辅助治疗和临床管理中的重要应用价值44。四、CtDNA指导转移性结直肠癌的疗效预测和耐药监测转移性结直肠癌(metastaticcolorectalcancer,mCRC)的
16、主要治疗手段包括手术切除、放疗、细胞毒化疗、靶向治疗和免疫治疗等，但仍有不少mCRC患者不能从治疗中获益。药物治疗的耐药和肿瘤本身的异质性是引起这些患者预后不佳的重要原因。为了更好地选择药物治疗方案，mCRC患者常常需要进行分子病理检测,检测内容包括DNA错配修复蛋白，KRAS、NRAS.BRAF突变状态等。在临床实践中，这些检测的对象主要是患者的肿瘤组织。随着检测技术日益成熟，血液中的CtDNA也可以进行相关分子病理检测，并且与肿瘤组织检测结果较为一致45,46。此外，mCRC患者的血液CtDNA状态具有一定的预后预测能力，例如在可切除的结直肠癌肝转移患者中，接受手术切除或术后药物治疗后的CtDNA状态仍是阳性的患者MRFS更短47。一项多中心前瞻性临床试验的结果表明，在接受2个周期一线化疗方案治疗的mCRC
