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1、附件14化妆品中二甲硝咪嗖等120种原料的检验方法DeterminationofDimctridazolcandOther119KindsofComponentsinCosmetics1范围本方法规定了化妆品中二甲硝咪嚏等120种抗感染药物的液相色谱-质谱联用法，包括定性筛查方法与定量测定方法。本方法适用于水剂类、膏霜乳液类、凝胶类、粉类、蜡基类、油基类等化妆品中二甲硝咪嚏等120种原料的定性筛查与定量测定。本方法所包含的二甲硝咪喋等120种原料的中文名称、英文名称、CAS号等信息详见附录2方法提要本方法以乙脂为溶剂提取样品中二甲硝咪嘤等120种原料，采用高效液相色谱仪分离，质谱检测器检测，根
2、据保留时间和特征离子对的相对丰度比定性，定量离子对峰面积定量，以标准曲线法计算含量。本方法中二甲硝咪喋等120种原料的检出限、定量下限及取样量为0.5g时检出浓度和最低定量浓度见附录B。3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的一级水。3.1 甲醇，色谱纯。3.2 乙睛，色谱纯。3.3 甲酸，色谱纯。3.4 氢氧化钠。3.5 三乙胺。3.6 硫酸二甲酯。3.7 石油酸(3060oC)o3.8 氢氧化钠溶液：称取1.2g氢氧化钠(3.4),置于25OmL烧杯中，加入100mL水，用玻璃棒搅拌至溶解，即得。3.9 含0.1%甲酸的20%乙晴溶液：量取2
3、0mL乙懵(3.2)于IOomL容量瓶中，加入(MmL甲酸(3.3),用水稀释并定容至刻度，摇匀，即得。3.10 0.4%甲酸溶液：准确量取2mL甲酸(3.3),置50OmL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度,摇匀，即得。3.11 标准品：二甲硝咪喋等120种原料的标准品信息详见附录A。为方便标准品溶液的配制，将120种原料分为三组，第一组为依诺沙星、米诺环素、甲氯环素、磺胺苯毗嗖、红霉素、螺旋霉素、替米考星、新康噗、伊曲康噗共9种，第二组为特比蔡芬、蔡替芬、联苯不嚏共3种，第三组为二甲硝咪哩等其余108种。3.12 单标标准储备溶液：精密称取二甲硝咪哇等120种原料的标准品（3.11）各IOmg
4、（精确至0.00001g）,置于不同IomL容量瓶中，加甲醇（3.1）使溶解并定容至刻度（标准品为盐酸盐、硝酸盐等盐类形态时加少量水助溶，毗咯米酸、恶哇酸、西诺沙星、氟罗沙星、克林沙星、妥舒沙星、磺胺喀哇等标准品加少量甲酸助溶，吠喃妥因、吠喃喋酮加少量乙般助溶），摇匀，制得质量浓度均为1mg/mL的120种单标标准品储备溶液。3.13 混合标准溶液（1）：分别准确量取第一组原料的单标标准储备溶液（3.12）各1mL,置于同一个20mL容量瓶中，用乙精（3.2）稀释并定容至刻度，制成质量浓度为50gmL的混合标准溶液（1）。3.14 混合标准溶液（2）：分别准确量取第二组原料的单标标准储备溶液（
5、3.12）各IoOiJL、第三组除环毗酮胺外的单标标准储备溶液（3.12）各ImL,置于同一个20OmL容量瓶中，用乙睛（3.2）稀释并定容至刻度，制成第二组原料的质量浓度为0.5gmL,第三组原料的质量浓度为5gmL的混合标准溶液（2）。3.15 环毗酮胺标准溶液：准确量取环毗酮胺标准储备溶液（3.12）100L,置于50mL容量瓶中，用乙胎（3.2）稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为2gmL的环毗酮胺标准溶液。3.16 0.1%甲酸溶液：准确量取1mL甲酸（3.3）,置IOoOmL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，摇匀，即得。3.17 0.1%甲酸乙庸溶液：准确量取1mL甲酸（3.3）,置IO
6、oOmL容量瓶中，用乙精（3.2）稀释并定容至刻度，摇匀，即得。4仪器和设备4.1 高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪。4.2 天平。4.3 超声波清洗仪。4.4 可控温离心机，转速不低于100Oor/min。4.5 涡旋混合仪。4.6 水浴锅。4.7 微孔滤膜（0.22m）,5测定步骤5.1 定性筛查5.1.1 筛查用标准溶液的制备5.1.1.1 除环毗酮胺外119种原料的筛查用标准溶液：分别准确量取混合标准溶液(1)(3.13)和混合标准溶液(2)(3.14)各100L,置于同一个25mL容量瓶中，用含0.1%甲酸的20%乙脂溶液(3.9)稀释至刻度，摇匀，制成第一组原料的质量浓度为200
7、ng/mL、第二组原料的质量浓度为2ng/mL、第三组原料的质量浓度为20ng/mL的筛查用混合标准溶液。5.1.1.2 环毗酮胺筛查用标准溶液：准确量取环毗酮胺标准溶液(3.15)50L于玻璃试管中,加乙脂(3.2)三1mL,照“5.1.2.2”下方法，自“准确加入氢氧化钠溶液(3.8)0.5mL”起同法操作，制成环哦酮胺筛查用标准溶液。5.1.2 样品处理5.1.2.1 样品处理(用于除环毗酮胺外119种原料)5.1.2.1.1 水剂类、膏霜乳液类、凝胶类、粉类、油基类样品：准确称取样品0.5g(精确至0.0001g),置于10mL具塞比色管中，加乙糖(3.2)2mL,振摇(必要时超声处理
8、)使样品分散均匀。加乙精(3.2)至IomL,剧烈振摇3min,超声处理20min,取出，放置至室温，涡旋10s,转移至具塞离心管中，密塞，以IooOOrmin转速4离心IOmin,吸取乙脐提取液，备用。准确量取上述乙懵提取液ImL,至5mL容量瓶中，加0.4%甲酸溶液(3.10)至刻度，摇匀，转移至具塞离心管中，密塞，以IoO(X)r/min转速4离心IOmin,吸取澄清溶液，经微孔滤膜(0.22m)(4.7)过滤，取续滤液，作为除环哦酮胺外119种原料的待测溶液。5.1.2.1.2 蜡基类样品：准确称取样品0.5g(精确至0.0001g),置于IOmL具塞比色管中，加石油酸(3060C)(
9、3.7)2mL,振摇(必要时超声处理)使样品分散均匀。加乙情(3.2)至IOmL,剧烈振摇3min,超声处理20min,取出，放置至室温，涡旋10s,转移至具塞离心管中，密塞，以IOooOiVmin转速4离心IOmin,吸取乙脂提取液，备用。准确量取上述乙精提取液ImL,至5mL容量瓶中，加10.4%甲酸溶液(3.10)至刻度，摇匀，转移至具塞离心管中，密塞，以IooOormin转速4离心IOmin,吸取澄清溶液，经微孔滤膜(0.22m)(4.7)过滤，取续滤液，作为除环毗酮胺外119种原料的待测溶液。5.1.2.2 样品处理(环毗酮胺)准确量取“5.121”项下备用的乙脂提取液1mL,置于玻
10、璃试管中，准确加入氢氧化钠溶液(3.8)0.5mL,混匀，再准确加入硫酸二甲酯(3.6)50L,涡旋30s,置于37C水浴中15min,取出，准确加入三乙胺(3.5)50L,涡旋30s,经微孔滤膜(0.22m)(4.7)过滤，取续漉液，作为环口比酮胺的待测溶液。注：硫酸二甲酯毒性强，使用时最好佩戴防毒面具，保持实验室通风，并密封贮存于干燥通风处，远离火种、热源，防止阳光直射。5.1.3 参考液相色谱-三重四极杆质谱联用条件1.1.1 .1色谱条件色谱柱：Ci8柱(100mm2.1mm3.5m)或等效色谱柱；流动相：正离子模式下，水相为0.1%甲酸溶液(3.16),有机相为0.1%甲酸乙胎溶液（
11、3.17）；负离子模式下，水相为水，有机相为乙胎（3.2）；梯度洗脱程序见表1。表1流动相梯度洗脱程序时间minV（水相）/%V（有机相）/%0.009551.009554.0080208.0040609.0059511.0059511.0195515.00955流速：0.3mL/min；柱温：室温；进样量：5Lo1.1.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESI源）；监测模式：正、负离子多反应监测模式，监测离子对及相关参数设定见附录C（可根据仪器情况进行调整）。5.1.4 定性判定取筛查用标准溶液（5.1.1）和待测溶液（5.1.2）,照“5.1.3”项下的条件进行测定，必要时用含0.1%甲酸
12、的20%乙懵溶液（3.9）稀释。样品中如呈现定量离子对和定性离子对的色谱峰，被测原料的特征离子峰保留时间与标准溶液对应的保留时间一致，且选择的定性离子的相对丰度比与相当浓度标准品溶液的定性离子的相对丰度比的最大偏差不超过表2的规定，则可以判定样品中存在对应的原料。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度（k）k50%50%k20%20%k10%k10%允许的最大偏差20%25%30%50%5.2定量测定当定性筛查（5.1）结果为阳性时，按下列步骤进行定量测定。5.2.1 基质标准系列溶液的制备5.2.1.1 除环毗酮胺外119种原料基质标准系列溶液：取与待测化妆品配方相同或相近的基
13、质空白样品5份，每份0.5g（精确至00001g）,置于IOmL具塞比色管中，分别加入混合标准溶液（1）（3.13）和混合标准溶液（2）（3.14）适量,照“5.121”下方法操作，制成基质标准系列溶液（第一组原料系列溶液的质量浓度分别为200、400、600、800.1000ng/mL,第二组原料系列溶液的质量浓度分别为2、4、6、8、10ng/mL,第三组原料系列溶液的质量浓度分别为20、40、60、80、IOongZmL）。标准系列溶液的浓度范围可根据实际情况进行调整。5.2.1.2 环毗酮胺基质标准系列溶液：取与待测化妆品配方相同或相近的基质空白样品5份,每份0.5g（精确至0.000
14、1g）,置于IOmL具塞比色管中，分别准确加入环毗酮胺标准溶液（3.15）适量，照“5.1.2”下方法操作，制成备用乙庸提取液（环哦酮胺的质量浓度分别为100、200、300、400、500ngmL）,标准系列溶液的浓度范围可根据实际情况进行调整。分别准确量取不同浓度的备用乙懵提取液ImL,置于玻璃试管中，准确加入氢氧化钠溶液（3.8）0.5mL,混匀，再准确加入硫酸二甲酯（3.6）50L,涡旋30s,置于37水浴中15min,取出，准确加入三乙胺（3.5）50L,涡旋30s,经微孔滤膜（0.22m）（4.7）过滤,续滤液作为环毗酮胺基质标准系列溶液。5.2.2 样品处理同“5.1.2”。5.
15、2.3 参考液相色谱-三重四极杆质谱联用条件同“5.1.3”。注：当磺胺曲沙嚏和磺胺异嗯哇、磺胺林和磺胺间甲氧喀咤等同分异构体采用“5.1.3”项下流动相梯度洗脱程序分离度不佳时，可采用表3所述流动相梯度洗脱程序进行测定。表3流动相梯度洗脱程序时间minV（水相）/%V（有机相）/%0.009552.009558.00901018.00782228.00455533.0059535.0059535.0195540.009555.2.4 定量测定取基质标准系列溶液依次测定，以待测原料的系列浓度为横坐标，待测原料的定量离子对峰面积为纵坐标，进行线性回归，建立基质标准曲线，其线性相关系数应不小于0.99。取待测溶液测定，将对应的定量离子色谱峰面积代入线性回归方程，按“6计算”项下公式，计算样品中待测原料的含量。6计算pVD（Jl）=m1000式中：一化妆品中待测原料的质量分数，mg/kg；P一待测溶液中待测原料的质量浓度，ng/mL；V样品定容体积，mL；m
