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1、附件5光反应性活性氧(ROS)测定试验方法ReactiveOxygenSpecies(ROS)AssayforPhotoreactivity1范围本方法规定了化妆品用化学原料光反应性活性氧(RoS)测定试验的基本要求和方法。本方法适用于预测化妆品用化学原料的潜在光毒性。2试验目的预测化妆品用化学原料是否具有潜在光毒性。3定义下列术语和定义适用于本方法。3.1 光反应性Photoreactivity化学物质由于吸收光子而与另一个分子发生反应的性质。3.2 光毒性Phototoxicity皮肤一次接触化学物质后，继而暴露于紫外线照射下所引发的一种皮肤毒性反应，或者全身应用化学物质后，暴露于紫外线照
2、射下发生的类似反应。本方法所述光毒性包括光刺激性、光过敏性和光遗传毒性。3.3 辐照度Irradiance照射到某一表面的紫外线或可见光的强度，单位为瓦每平方米(Wm2)或亳瓦每平方厘米(mVcm2)o3.4 光照剂量Doseoflight照射到某一表面的紫外线或可见光的量=强度X时间(秒),单位为焦耳每平方米(Jm2)或焦耳每平方厘米(Jcm2)。3.5 活性氧种类ReactiveOxygenSpecies,ROS活性氧种类，包括单线态氧和超氧阴离子。3.6 单线态氧SingIetOxygen,SO由光辐照化学物质通过11型光化学反应产生的一种自由基。3.7 超氧阴离子SuperoxideA
3、nion,SA由光辐照化学物质通过I型光化学反应产生的一种自由基。4试验原理一些具有光反应性的化学物质暴露于紫外线时，吸收某一波长光子，诱导发色团激发，激发能量转移到氧分子上，发生光化学反应，产生活性氧（包括单线态氧SO和超氧阴离子SA）,活性氧是光毒性反应中的重要中间物质。单线态氧和咪哇反应生成的过氧化物中间体对N,N-二甲基-4-亚硝基苯胺（RNo）具有漂白作用，使其在440nm下的吸光度降低。超氧阴离子与氯化硝基四氮嘎蓝（NBT）反应生成NBT+,其在56Onm波长下具有光吸收。本试验方法通过分光光度法测定化学物质经紫外线照射后对RNo在440nm下吸光度的减少及对NBT+在560nm下
4、吸光度的增加来判断该化学物质是否具有光反应性。5试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的一级水。所有试剂应在配制后1个月内使用，并且在使用前应超声处理，以免物质析出、沉淀对试验造成影响。主要试剂配制方法如下：5.1 磷酸二氢钠。5.2 磷酸氢二钠。5.3 N,N-二甲基-4-亚硝基苯胺（RNO）。5.4 咪%5.5 氯化硝基四氮噗蓝（NBT）。5.6 pH7.4的20mmol/L磷酸钠缓冲液（NaPB）称取593mgNaH2P042H20（CAS：13472-35-0）和5.8gNa2HPO4-12H2O（CAS:10039-32-4）,加入约90
5、OmL水，混匀，用ImoI/L的HCI将PH值调节为7.4,定容至IOoOmL后混匀。于28冰箱或室温保存。5.7 0.2mmol/LN,N-二甲基4亚硝基苯胺（RNO,CAS：138-89-6）称取3mgRNO,溶于IOomL20mmol/L的磷酸钠缓冲液中，充分混匀。于2C8C冰箱避光保存。5.8 0.2mmol/L咪噗（CAS：288-32-4）称取13.6mg味喋，溶于IOmL20mmol/L的磷酸钠缓冲液中，充分混匀，得到20mmol/L咪嗖溶液。用20mmol/L的磷酸钠缓冲液将20mmol/L咪噗溶液稀释100倍，充分混匀。于28冰箱避光保存。5.9 0.4mmol/L氯化硝基四
6、氮嘎蓝（NBT,CAS：298-83-9）称取32.7mgNBT,溶于IoOmL20mmol/L的磷酸钠缓冲液中，充分混匀。于28冰箱避光保存。5.10 溶剂的选择优先使用分析级二甲基亚碉（DMSo）O对于不溶于DMSO的受试物，可使用20mmol/L的磷酸钠缓冲液作为溶剂。如果受试物在DMSo和磷酸钠缓冲液中不溶或不稳定，也可使用其他溶剂，但应保证受试物在所选溶剂中稳定，且参考化学物质的SO值和SA值应在附录A规定的范围内。5.11 待测化学物质溶液的配制待测化学物质的分子量应是已知的。测试终浓度为200moIL,如果在200molL浓度下的反应混合物有沉淀、着色或其他干扰等现象，则可以使用
7、20molL为终浓度进行测试。当待测化学物质在20molL的终浓度下得到阳性结果，表示该物质具有光反应性：但在浓度低于20molL下得到阴性结果，不能表示该物质无光反应性。待测化学物质溶液应现用现配，所有操作均应避免在强紫外线和强可见光照射（例如头顶灯下或在自然光暴露的窗户附近工作），以避免在试验前待测化学物质发生光激活或光降解。待测化学物质在试管中称重,加入5.10项溶剂,涡旋混匀,超声5-10min,配制成10mmol/L（终浓度200molL）。当终浓度200molL的反应混合物在光照前观察到沉淀、着色或其他干扰等现象时，需将IommOI/L的溶液用DMSo稀释成1mmol/L溶液（终浓
8、度20molL）。对于不溶于DMSo的化学物质，使用其他溶剂（如磷酸钠缓冲溶液）时，须使得反应混合物中含有20LDMSO（2%,vv）。5.12 阴性对照及阳性对照以奎宁盐酸盐二水合物（CAS：611947-7）作为阳性对照，以二苯甲酮4（CAS:4065-45-6）作为阴性对照。用DMSO按与受试物相同的方法将阳性对照和阴性对照配制成10mmol/L的储备溶液，分装后于-20C冰箱冻存，于使用当天解冻，避免反复冻融，1个月内使用完毕。6仪器和设备6.1 太阳光模拟器6.1.1 选择合适的光源用于提供紫外线和可见光的照射，通过滤光片减少波长小于290nm的UVC,使光源尽量接近室外日光。推荐的
9、测试条件如下：a） 配备滤光片的太阳模拟器（减少紫外线波长290nm）（见附录B）一辐照度：1.8mWcm2至2.2mWCm2,照射I小时（例如,AIlaSSUnteStCPS+的指标设置值为250Wm2）,-UVA光照齐IJ量：6.5Jcm2至7.9Jcm2（见附录B）。b） 配备滤光片的太阳模拟器（减少紫外线波长30Onm）（见附录B）-辐照度：3.0mWcm2三5.0mWcm2,照射1小时（例如,SericSXL-2500V2）,一UVA光照剂量：llJcm2至18Jcm2（见附录B）。6.1.2 测试条件根据实际选择合适具体条件。6.1.3 ROS的产生受温度影响，太阳光模拟器应配备温
10、度控制装置，光照期间温度在20C29*C,6.2 反应容器推荐使用石英反应容器（规格见附录C）,避免液体蒸发以及由于塑料盖造成的UV损失。也可使用其他UV透射率大于95%的盖子或密封件替代。实验室使用其他容器时，应使用附录A中的参考化学物质（序号1-17号）确定合适的仪器辐照度及光剂量。6.3 酶标仪。6.4 UVA紫外照度计。6.5 显微镜。7分析步骤7.1 将下列成分在避光条件下混合：7.1.1溶剂为DMSO的受试物:单线态氧SO超氧阴离子SA20mmol/LNaPB480L0.2mmol/L咪噗250L0.2mmol/LRNO250L10或1mmol/L受试物20L20mmol/LNaP
11、B855L0.4mmol/LNBT125L10或1mmol/L受试物20L7.1.2溶剂为NaPB的受试物:单线态氯SO超氯阴离子SA20mmolLNaPB460L0.2mmol/L咪噗250L0.2mmol/LRNO250LDMSO20L10或1mmol/L受试物20L20mmolLNaPB835L0.4mmol/LNBT125LDMSO20L10或1mmol/L受试物20L以20L溶剂替代受试物，作为空白对照。涡旋或超声510min后，将200L反应混合物加入到96孔板中，每组设置3个平行。96孔板加样详见附录D。7.2 在100倍显微镜下检查反应混合物中各组分溶解情况。如有沉淀、析出等现
12、象，需降低受试物浓度重新检测或停止检测。将96孔板震荡5S后，使用分光光度计或酶标仪测定光照前SO检测孔在440nm下的吸光度及SA检测孔在560nm下的吸光度。7.3 将96孔板置于石英反应器中，或盖上其他具有高UV透射率的盖子或密封件，置于太阳光模拟器中照射1ho记录光照前后的温度。7.4 完成光照后，将96孔板震荡1min,使用分光光度计或酶标仪测定光照后SO检测孔在440nm下的吸光度及SA检测孔在560nm下的吸光度。步骤流程图见附录E8分析结果表述8.1SO值和SA值的计算计算受试物及对照品的SO值和SA值，根据三个平行孔的数据计算平均值和标准偏差。1 .根据光照前后SO测试孔在4
13、40nm下的吸光度计算受试物的SO值SO值=440(一)-l440(+)-(a-b)1000式中：AuoG):光照前44Onm下的吸光度A44o(+):光照后44Onm下的吸光度a：光照前空白对照44Onm下的吸光度(平均值)b：光照后空白对照440nm下的吸光度(平均值)2 .根据光照前后SA测试孔在560nm下的吸光度计算受试物的SA值SA值=i4560(+)i456o(一)(ba)100O式中：A56o(一):光照前56Onm下的吸光度A56o(+):光照后560nm下的吸光度a：光照前空白对照56Onm下的吸光度(平均值)b：光照后空白对照560nm下的吸光度(平均值)8.2试验接受标
14、准试验应满足以下标准：1 .光照前，反应混合物中没有受试物沉淀。2 .光照前后，受试物对反应混合物没有颜色干扰。3 .试验过程中温度控制在20C29C范围内。4 .所有测试孔A440及A560应在0.021.5范围内。5 .应根据历史数据平均值2标准偏差建立实验室内阴性对照与阳性对照的质控范围。以下为根据验证数据得出的95%置信区间：200molL奎宁盐酸盐二水合物200molL二苯甲酮-4SO：319至583SA：193至385SO：-9至11SA：-20至28.3受试物的光反应性评判标准根据以下标准评判受试物的光反应性:分类样品浓度SOSA25和70具有光反应性200molL7025和70
15、和/或有干扰具有弱光反应性200molL20,70具有光反应性20molL25和20无光反应性200molL25和20不确定不属于上述任何一种情况如受试物在200moIL和20molL浓度下均有沉淀、着色或其他干扰，则认为该受试物不适用于本方法，受试物的光反应性不确定。9其他限制说明在活性氧（ROS）检测过程中，会发生如下两个反应：单线态氧和咪嗖反应生成的过氧化物中间体对N,N二甲基4亚硝基苯胺（RNO）具有漂白作用；超氧阴离子与氯化硝基四氮噗蓝（NBT）反应生成NBT+。该方法不适用于对上述两个反应产生干扰的化学品测试，例如，抗坏血酸和其他还原性化学品，它们会将四嗖盐直接还原为甲瓒，抗坏血酸还加速咪唾衍生物的氧化，在ROS测定中提供假阳性预测。附录A参考化学物质
