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1、慢性胰腺炎易感基因及致病机制研究新进展CP是一种与遗传因素密切相关的慢性进行性炎症性疾病，临床表现为腹痛、胰腺内外分泌功能不全(糖尿病、脂肪泻)等，病理特征主要是胰腺纤维化、钙化、萎缩、胰管不规则扩张、假性囊肿等。经典的CP致病基因包括阳离子胰蛋白酶原(Serineprotease1,PRSS1)、丝氨酸蛋白酶抑制剂KaZal1型(SerinepeptidaseinhibitorKazaItype1,SPINKI)、胰凝乳蛋白酶C(chymotrypsinC,CTRC)和囊性纤维化跨膜转导调节因子(cysticfibrosistransmembraneconductancereguIator,
2、CFTR)o虽然酒精、吸烟等环境因素和上述已知的基因突变等遗传因素被证实是CP的重要危险因素，但仅能解释不到50%的CP患者发病风险。本文就近年来新发现的CP易感基因及其致病机制做系统阐述，以加深对CP发生机制的认识。#一、CP易感基因随着高通量基因测序技术的应用发展，通过靶向测序、全基因组测序(WhOle-genomesequence,WGS)和全外显子测序(whoIe-exomesequence,WES)等方法定位CP易感基因位点，可以明确遗传因素与疾病的关联。全基因组关联分析(genome-wideassociationstudies,GWAS)利用单核甘酸多态性(singlenucle
3、otidepoIymorphism,SNP)标记信息和表型信息分析，定位与疾病相关的基因突变。WES对基因组所有外显子捕获富集后进行高通量测序。近年来，运用以上技术定位了几种与CP相关的易感新基因位点。1 .紧密通道蛋白2(claudin-2,C1.DN2)和染色质重塑蛋白MORC家族CW型锌指结构蛋白4(microrchidiafamiIyCW-typezincfinger4,M0RC4):2012年，美国一项GWAS研究首次发表了与CP关联度最高的SNP位于Xq23.3,即C1.ND2基因座。C1.DN2基因编码ClaUdin-2蛋白，该蛋白作为一种高度可调控的紧密通道蛋白，在内皮细胞间形
4、成孔道,并具有阳离子通透性，通常以低水平在胰管和胰岛细胞的紧密连接中表达。C1.DN2基因座包含的其他基因有MoRC4、RIPP1.Yl和TBClD8B。研究进一步显示，与复发性急性胰腺炎相比,C1.DN2-M0RC4基因座rs12688220的变异与CP相关性更强，且与酒精性慢性胰腺炎(alcoholicchronicpancreatitis,ACP)显著相关。随后，德国、日本、印度等研究相继论证了M0RC4rs12688220与ACP显著关联，RIPP1.Y1rs7057398与女性的非酒精性慢性胰腺炎(non-alcoholicchronicpancreatitis,NACP)相关，无地
5、域种族差异。2020年，Deng和U的荟萃分析结果显示，rs12688220和rs10273639的基因多态性可用于识别亚洲人群中易感CP的个体。笔者所在课题组通过低深度全基因组测序发现，rs12688220和rs10273639均可增加CP患病风险,其中饮酒可通过剂量依赖关系显著增加rs10273639的致病风险。2 .胰脂肪酶(PanereaticIipase,PN1.IP):2014年，Behar等对常染色体隐性遗传的先天性PN1.lP缺乏症进行谱系研究，首次报道了PN1.lPp.T221M的纯合子错义突变是引起胰腺外分泌功能障碍表型的原因。2019年，1.aSher等发现PN1.lP错
6、义突变在2个独立的欧洲NACP患者队列中更为显著，其中最常见的突变体为p.F3001.(rs890551695)。功能实验发现5个PN1.lP突变体对蛋白水解敏感，表现为被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的加速降解，且与早发型CP密切相关。但在非欧洲(日本、美国、印度)NACP患者中未检测到对蛋白酶敏感的PN1.IP突变。PN1.IP增加了CP易感风险，但也由于其对蛋白水解敏感，减轻了疾病的严重程度，具体致病机制有待进一步阐明。3 .ABO糖基转移酶A/B和岩藻糖基转移酶2(fucosyItransferase2,FUT2):一项基于人群的研究发现，血清脂肪酶活性阈值的升高(23.17HmOlsl)与肾
7、功能损害、高龄或各种调节免疫系统的药物相关。而这些因素都提示可能与亚临床胰腺损伤或胰腺显性疾病相关。2014年WeiSS等展开GWAS和复制研究，确定了ABO基因座(rs8176693)、FUT2基因座(rs632111)与无症状受试者的血清脂肪酶活性表型显著相关。进一步研究发现，次要等位基因ABOrs8176693_T是决定血型B的ABO单倍型；FUT2基因座与分泌状态的关联分析显示，rs632111_G与FUT2蛋白的非分泌状态相关。FUT2蛋白分泌与非分泌状态决定了个体将ABO血型抗原分泌到体液中的能力。继而对1042例胰腺炎患者行相关性分析得出，与血清脂肪酶活性增加相关的非分泌状态FU
8、T2(0R=1.53)和ABO血型中的B型血(OR=I.69)是CP患者的风险因素。4 .胰凝乳蛋白酶原B1和B2(chymotrypsinogenB1andB2,CTRB1-CTRB2)：CTRBI-CTRB2基因突变对CP致病影响存在种族差异性。2017年，欧洲一项纳入1959例ACP和1650例NACP患者的GWAS研究显示，CTRBI-CTRB2基因位点存在16.6kb片段的倒置重组，导致rRNA转录水平上CTRB1/CTRB2亚型表达比升高和胰蛋白酶降解减少，以连锁不平衡方式增加了ACP和NACP风险，CTRBl片段1号内含子SNPrs8055167(0R=1.35)与ACP明显相关
9、。然而，笔者所在的课题组通过纳入一项1036例ICP患者的研究，结果显示倒置重组的CTRBI-CTRB2、rs8048956和rs8055167突变在中国人群中因等位基因固定现象而与ICP发病风险无显著相关。最近，德国一项对337例CP的CTRBI-CTRB2基因型研究显示，存在CTRBlp.W51.、CTRB2的5,非翻译区c-4CT和p.A247T的错义突变，但未发现与CP发病显著相关。5 .瞬时受体电位阳离子通道亚家族V6(transientreceptorpotentiaIvaniIloidsubfamiIymember6,TRPV6):TRPV6基因编码选择性钙离子通道蛋白。2016
10、年意大利一项靶向测序研究首次报道了在ICP患者中存在TRPV6基因错义突变位点。2020年一项多中心WES和靶向测序研究显示，日本及欧洲C去国、德国)NACP患者存在多个TRPV6功能缺失型突变位点(p.R174X,p.A606T,p.1.608R,p.1.609F),日本患者p.D324N和欧洲患者p.1.299Q突变可导致无Mg2+胞内灌注下TRPV6通道电压依赖性阻断，使膜通道功能障碍而诱发CPo笔者所在课题组通过对669例CP患者进行测序及功能研究发现，TRPV6功能缺失型突变与CP显著相关，在25个突变位点中的4个功能缺失型突变位点(p.1.172P.p.A473T、p.Y507*和
11、p.E575K)可导致TRPV6蛋白质翻译显著下降。此外，最新的一项研究也表明，在两个独立的欧洲队列中TRPV6功能缺失变异与CP风险升高相关。#二、遗传致病机制CP易感基因突变和重组引起基因转录和翻译产物的结构和功能异常，通过遗传致病机制包括胰蛋白酶(原)相关通路、蛋白质错误折叠、细胞凋亡或坏死、自噬障碍、钙离子信号通路异常和肠道微生态失调等，促进疾病的发生和发展。1 .胰蛋白酶（原）相关通路：近年来对CP易感基因突变的研究主要集中在引起活性胰蛋白酶水平升高致组织损伤的胰蛋白酶（原）相关通路上，如PRSS1、CTRC.SPINK1等位点突变导致胰蛋白酶（原）异常激活、胰蛋白酶降解障碍或抑制酶
12、活性降低。PRSS1p.N29l/T和p.R122H促进胰蛋白酶原自我激活，p.N29I/T、p.V39A、p.R122C/H抑制CTRC介导的胰蛋白酶原降解，p.A16V和p.N29l促进依赖CTRC的胰蛋白酶原激活肽N端加工所致的胰蛋白酶原自激活。PRSS2基因编码阴离子胰蛋白酶原，p.G191R产生新的剪切位点Arg191-Gly192致激活后快速降解，使胰蛋白酶活性丧失，在CP中起保护作用。笔者所在课题组基于PUbMed搜索的含法国、中国等人群中PRSS1和PRSS2基因的拷贝数或SNP位点，以及基因动物模型分析，发现增加胰蛋白酶的表达量可显著增加CP风险与疾病严重程度，这为未来研发干
13、预药物提供了理论基础。CTRCp.G217RS.p.K247_R254deI和p.R254W易被胰蛋白酶降解。功能缺失型SPINK1突变使抑制胰蛋白酶自激活的保护机制丧失。笔者所在课题组通过体外构建全长SPINKl基因质粒，发现SPINKlc.194+2TC改变3号内含子5剪切位点，从而导致外显子跳跃，使SPINK1mRNA表达显著降低；c.108GT、c142TC和c.147AG显著降低启动子活性，增加疾病风险；与c.194+2TC关联的c.215GA位点突变可增加启动子活性，补偿并降低转录区突变的有害影响。CFTRp.M470V与关联突变位点p.Q1352H或p.1.1156F能显著减少C
14、FTR表达和降低Cl一/HC03一转运活性，使导管内碱性胰液分泌减少，易致蛋白沉积和PH降低，进而促进胰酶激活，其具体机制仍需深入研究。2 .蛋白质错误折叠内质网应激通路：基因突变导致翻译的蛋白质未折叠或错误折叠，并在细胞内蓄积，引起内质网应激和蛋白质毒效应(酶分泌减少及活性下降)。CE1.p.C563fsX673使编码的蛋白形成异常二硫键，在胞内以不可溶形式聚集，引起内质网应激、NF-B通路激活和细胞凋亡标志物PARP降解产物增加。CE1.-HYBI及其双位点错义突变(Thr48872548)均可引起胞内不溶性蛋白聚集和内质网应激。笔者所在课题组通过构建人源性CE1.-HYB1基因杂合变异小
15、鼠，发现该变异随着小鼠年龄的增长，可自发局部胰腺病变，增加雨蛙素诱导的胰腺炎严重程度，并伴随蛋白质错误折叠和内质网应激，晚期出现自噬障碍。Hegyi和Sahin-T6th构建的CPA1N256K突变小鼠模型可使蛋白错误折叠和蓄积，引起内质网应激，且导致腺泡细胞空泡化增加、巨噬细胞浸润、组织纤维化等CP特征性病理改变。3 .自噬障碍：自噬对维持胰腺腺泡细胞的生理功能及稳态起重要作用。FjeId等研究显示，CE1.-HYBI可致分泌障碍、异常蛋白胞内聚集，而微管相关蛋白1轻链3-Il(microtubuIeassociatedprotein1Iightchain3-Il,1.C3-I)升高提示存在
16、自噬功能障碍。研究显示自噬相关蛋白5基因(autophagyrelated5,ATG5)缺乏引起p62蓄积，激活Nrf2Nqo1p53信号通路致胰腺组织坏死、炎症反应和纤维化。Mareninova等发现敲除溶酶体相关膜蛋白-2(IysosomaIassociatedmembraneprotein-2,1.AMP-2)基因的小鼠出现自发CP病理改变，组织中自噬溶酶体蓄积、腺泡细胞空泡化与增加的1.C3-11和p62SQSTM1相关的自噬流缺陷有关。1.i等发现剔除IKB激酶Q亚基(IKBkinase,IKKQ)基因的PdXl-Cre,IkkaF/F杂交小鼠出现自发CP病理改变，与IKKQ缺乏引起自噬障碍、内质网应激、氧化应激和p62蓄积有关。4 .钙离子信号通路异常：胞内钙超载可导致酶原异常激活、线粒体损伤、自噬异常和细胞坏死，在胰腺炎发生和发展中起重要作用。TRPV6功能缺失型突变可使TRPV6蛋白表达减少，细胞内钙离子运输显著受损。研究显示内质
