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1、抗黏液蛋白1单抗偶联吉西他滨聚鼠基丙烯酸正丁酯纳米粒对胰腺癌模型动物抑瘤作用的实验研究胰腺癌是严重威胁国人健康与生命的一种恶性肿瘤，近年来发病率及死亡率呈快速上升的趋势。胰腺癌早期无明显症状，难以发现，确诊时大多为进展期，又缺乏有效的治疗手段，故预后极差。因此针对晚期胰腺癌有效而不良反应低的治疗方法是目前研究的热点。本课题组先期研究以抗表皮生长因子受体(epidermaIgrowthfactorreceptor,EGFR)作为靶点，将抗EGFR抗体偶联到载吉西他滨聚氯基丙炜酸正丁酯纳米微球(EGFR-GEM-PBCA-NP),用于治疗胰腺癌移植瘤，结果显示有一定的靶向性和抑瘤作用，但效果不甚理
2、想。近年来黏液蛋白1(mucin1,MUC1)作为新的靶点进入了研究者的视野。因MUCl在胰腺癌组织的表达率高达80%,故本课题组将抗MUCl单克隆抗体偶联到GEm-PBCA-NP,通过胰腺癌PANCl细胞株的体外实验，显示MUCl-GEM-PBCA-NP能抑制癌细胞的增殖。本研究进一步行MUCI-GEM-PBCA-NP治疗胰腺癌的动物体内实验。一、材料与方法1 .MUCl-GEM-PBCA-NP制备:MUC1单抗购自AbnOVa公司。GEM-PBCA-NP的制备参考李春梅等方法。将GEM-PBCA-NP与抗MUCl单克隆抗体完全混合溶于pH7.4的SBF溶液，低速磁力搅拌下按一定比例加入碳二
3、亚胺溶液，混均后离心取沉淀。超声分散沉淀物后，用去离子水洗涤4遍，冷冻干燥获取抗MUC1单抗与GEm-PBCA-NP的交联物(Muci-GEM-PBCA-NP)o应用激光散射粒度分析仪(ZetasizerNanoZS90型，英国马尔文公司)观察微球粒的大小及抗体的分布，计算包封率及载药率。包封率二纳米微球粒实际载药量/总投药量XIO0%;载药率二纳米微球粒实际载药量/称取的纳米微球粒质量X100%。2 .体内抑瘤实验：人胰腺癌细胞株PANCl由北京富众科技发展有限公司提供，常规复苏、培养、传代。BA1.B/c裸鼠45只，56周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司。参考马琳等及李春梅等方法制备荷瘤
4、裸鼠模型，即取0.2ml(6107ml)PANC1细胞悬液注射于裸鼠右侧腋部皮下，待瘤体最大径0.5CrTl(需710d)为建模成功。共39只裸鼠成功建模，按数字表法将其中35只随机分为5组，每组7只。MUCI-GEM-PBCA-NP组，经尾静脉注射2.5mgkg吉西他滨(gemcitabine,GEM)等药剂量的MUC1-GEM-PBCA-NP;GEM-PBCA-NP组，经尾静脉注射等药剂量GEM-PBCA-NP；GEM组：经尾静脉注射GEM2.5mgkg;单纯纳米颗粒组(PBCA-NP组)，经尾静脉注射等容积PBCA-NP;对照组，经尾静脉注射等容积生理盐水。每5d重复治疗1次，每3d测量
5、1次肿瘤长径(a)和短径(b),计算肿瘤体积(V),V=ab2/2o实验开始后第15天及第30天上IVIS1.umina1.T小动物活体成像系统(美国PerkinElnler)行活体生物发光检测成像并记录，生物发光实验参考王剑超等方法。第30天处死裸鼠，剥离瘤体称重，计算抑瘤率。抑瘤率=(对照组瘤重一实验组瘤重)/对照组瘤重100%o3 .统计学处理：使用SPSS17.0软件进行数据分析。计量资料以xs表示，组间比较采用单因素方差分析。计数资料以百分率表示，组间比较采用X2检验。PVO.05为差异有统计学意义。二、结果1 .各组纳米粒子电镜下观察结果：MUC1-GEM-PBCA-NP组电镜下观
6、察制备的纳米颗粒形态为光滑的球形，药物GEM细颗粒均匀地分散在聚合物基质中oGem-PBCA-NP组和Muc-Gempbca-Np组纳米粒大小分别为(49.626.17)nm和(58.146.44)nmoGEM-PBCA-NP组和MUCl-GEM-PBCA-NP组纳米粒中GEM的包封率分别为(44.524.22)%、(47.193.63)%,载药量分别为(7.240.71)%、(6.850.56)%o表面修饰后纳米粒子并无明显变化，表明MUCl-GEM-PBCA-NP靶向载药纳米粒子制备成功。2 .MUC1-GEM-PBCA-NP1的裸鼠移植瘤抑瘤效果：治疗后30d,MUCl-GEM-PBCA
7、-NP组、GEM-PBCA-NP组、GEM组裸鼠的抑瘤率显著高于PBCA-NP组及对照组，MUC1-GEM-PBCA-NP组抑瘤率又显著高于GEM-PBCA-NP组、GEM组，差异均有统计学意义（P值均0.05）,而GEm-PBCA-NP组与GEM组抑瘤率差异无统计学意义（图1,表1）。(EE)忠超g-s-H表1各组裸鼠治疗后301的肿瘤体重及抑瘤率（无s）组别只数肿瘤体重（mg）抑瘤率（）MlCi-GeM-PBCA-NPI组7471.6112.1668.141.66GeM-PBCA-NPI组7859.44I4.29a41.940.93GEM组7787.8422.68ab46.781.17/P
8、BCA-NPffl71463.1527.55j,I.I60.07j,对照组71480.3431.67*注:与MUCIGEMPBCA-NPl组比较JPVo.05；与PBCA-NPffifi对照组比较,叩（0.05-为无数据3 .裸鼠移植肿瘤的光子量变化：MUC1-GEM-PBCA-NP组、GEM-PBCA-NP组、GEM组、PBCA-NP组及对照组治疗前移植瘤基础光子量均值分别为3.440.56、4.010.59、3.790.61、4.200.62、3.640.56,各组间差异均无统计学意义；治疗第15天移植瘤光子量均值分别为7.210.76、14.481.34.13.771.52.27.25士
9、3.56、29.522.43,其中MUCI-GEM-PBCA-NP组显著低于其余各组（P值均0.05,图2）,GEM-PBCA-NP组和GEM组又显著低于PBCA-NP组和对照组（P值均0.05）,其余组间差异均无统计学意义；治疗第30天移植瘤光子量均值分别为9.460.89、17.271.89.18.431.98,36.154.98、38.3824.22,其中MUC1-GEM-PBCA-NP组显著低于其余各组（P值均0,05）,GEM-PBCA-NP组和GEM组也显著低于PBCA-NP组和对照组（P值均0.05）,其余组间差异均无统计学意义。MUCI-GEM-PBCA-NP组给药第15天和第
10、30天的移植瘤光子抑制率分别为67.27%和74.29%o讨论近年来纳米载药系统成为一个主要的研究方向。国内外已经有采用纳米载药系统进行胰腺癌治疗的研究,如金纳米粒子、碳纳米管、纳米二氧化硅和超顺磁性、氧化铁纳米粒子等无机纳米粒子以及白蛋白纳米粒子、壳聚糖纳米粒子等有机纳米粒子在胰腺癌诊断、治疗方面已取得一定成绩，但仍有诸多问题需进一步解决，其中分子靶点问题是一个研究热点。MUC是一类大分子量糖蛋白，在正常生理状态下，MUC的表达具有明确的组织特异性和时间特异性。在病理状态下，MUC表达异常是许多疾病及肿瘤的特征，尤其在胰腺癌组织中，MUC1异常表达已被研究证实。已有研究以MUC1作为引导纳米
11、粒子的靶向分子，显示在胰腺癌中具有良好的导向作用。张重捷等制备了抗MUCl单克隆抗体靶向修饰的探针超顺磁纳米颗粒，体内实验结果显示，该纳米颗粒可以选择性她积聚在裸鼠移植瘤内，可作为磁共振检查时特异性显影剂使用，提示MUC1作为靶点治疗胰腺癌的可行性。因此本研究也采用抗MUCl单克隆抗体靶向修饰载GEM纳米微粒的类似策略。聚氯基丙烯酸正丁酯纳米微粒（PBCA-NP）作为药物载体具有颗粒大小适中，可避免内皮网状系统吞噬，快速分布于组织，具有优良的药物缓释作用，本课题组前期的体外细胞实验已显示其良好的载药及药物释放作用。本研究结果显示，MUC1-GEM-PBCA-NP对于裸鼠胰腺癌移植瘤的抑制作用明
12、显优于无抗体偶联的GEm-PBCA-NP及GEM直接的药物作用，而GEm-PBCA-NP与GEM的抑制作用未见明显差异，提示抗MUCl单抗对于载GEM纳米微粒的动物体内导向作用较为显著,与本课题组前期的体外实验结果一致。本研究通过肿瘤生长曲线、肿瘤体重计算及活体生物发光显像等方法评估MUC1-GEM-PBCA-NP的抑瘤效果，各方法总体结果基本一致，其中以肿瘤体重计算的MUC1-GEM-PBCA-NP组抑瘤率略低于活体生物发光光子量计算的抑瘤率，但差异无统计学意义，初步证实了抗MUCl单抗修饰的载GEM纳米微球在动物模型体内能够通过血行转运，克服内皮网状系统吞噬等诸多不利因素的影响而到达胰腺癌移植瘤组织内，从而产生良好的抑制肿瘤生长的作用。
