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1、组织工程学天然高分子材料胶原骨组织的等级结构Hierarchical architechture of bone骨的等级结构（1）密质骨和松质骨；（2）密质骨骨单位和哈氏管，（3）骨层板和（4）胶原纤维 组成的胶原纤维束胶原纤维结构组成 胶原分子中间部分的氨基酸排列。（a）每个第三个氨基酸残基是甘氨酸，X 和 Y通常是脯氨酸和羟脯氨酸残基，（b）甘氨酸是最小的氨基酸，（c）三股螺旋使得甘氨酸残基指轴内，而另外两个残基处于螺旋表面，（d）脯氨酸和羟脯氨酸的残基与多肽链结合，增强分子的刚性。疏松结缔组织疏松结缔组织 成纤维细胞、成纤维细胞、巨噬细胞巨噬细胞 浆细胞、浆细胞、肥大细胞肥大细胞 细胞：
2、脂肪细胞细胞：脂肪细胞 未分化的间充质细胞未分化的间充质细胞 白细胞白细胞p组成：组成：胶原纤维胶原纤维 纤维：纤维：弹性纤维弹性纤维 网状纤维网状纤维 蛋白多糖蛋白多糖 基质：基质：纤维粘连蛋白纤维粘连蛋白 组织液组织液Typical Extracellular matrix细胞外基质（extracellular matrix,ECM）pECM是细胞外大分子构成的网络。包括：胶原、是细胞外大分子构成的网络。包括：胶原、非胶原糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖、弹性蛋白非胶原糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖、弹性蛋白等。等。p结缔组织中含量较高。结缔组织中含量较高。p影响细胞的存活、死亡、增殖和分化。影响细
3、胞的存活、死亡、增殖和分化。Collagen 胶原胶原p胶原是动物中的主要纤维蛋白，是所有多细胞动物，包括胶原是动物中的主要纤维蛋白，是所有多细胞动物，包括海绵体、无脊椎动物和脊椎动物的细胞外基质的主要结构海绵体、无脊椎动物和脊椎动物的细胞外基质的主要结构成分。成分。p胶原原纤维占人和高等动物总蛋白量可高达胶原原纤维占人和高等动物总蛋白量可高达30%，其作用，其作用是保持组织完整以及提供每一个结缔组织所需要的特殊力是保持组织完整以及提供每一个结缔组织所需要的特殊力学性能。学性能。p人体中有人体中有16左右是蛋白质，胶原占体内蛋白质总量的左右是蛋白质，胶原占体内蛋白质总量的3040，主要存在于皮
4、肤、肌肉、骨骼、牙齿内脏和，主要存在于皮肤、肌肉、骨骼、牙齿内脏和眼睛瞪部位。眼睛瞪部位。p从生物医学角度，胶原在发育、伤口愈合、血小板活化和从生物医学角度，胶原在发育、伤口愈合、血小板活化和血管生成中具有重要作用。另外很多遗传病的起因也被证血管生成中具有重要作用。另外很多遗传病的起因也被证明是由于胶原发生了突变，而胶原在其合成、降解或免疫明是由于胶原发生了突变，而胶原在其合成、降解或免疫学方面的微小变化也可以引起许多疾病。学方面的微小变化也可以引起许多疾病。胶原的结构p胶原是一类由胶原是一类由20种常见的氨基酸合成而来的蛋白种常见的氨基酸合成而来的蛋白质，但是它在氨基酸组成、重复的序列模式、
5、高度质，但是它在氨基酸组成、重复的序列模式、高度的翻译后修饰和特有的分子内交联上别具一格。的翻译后修饰和特有的分子内交联上别具一格。p天然的胶原蛋白是一个由天然的胶原蛋白是一个由螺旋的链相螺旋的链相互缠绕形成互缠绕形成的分子。胶原的超螺旋结构的分子。胶原的超螺旋结构是靠链间氢键以及螺旋和超螺旋的反向盘绕维持其是靠链间氢键以及螺旋和超螺旋的反向盘绕维持其稳定性的。稳定性的。p原胶原：原胶原：3条肽链形成的螺旋，含三种结构：螺旋条肽链形成的螺旋，含三种结构：螺旋区、非螺旋区及球形结构域。区、非螺旋区及球形结构域。Structural features pAll collagen molecules
6、 are trimers consisting of three polypeptide chains,called chains.pAlong at least part of their length,the three polypeptide chains of a collagen molecule are wound around each other to form a unique,rod-like triple helix.p 一个典型的胶原分子长一个典型的胶原分子长300nm、直径为、直径为2.5nm。在每一条左手螺旋的胶原链内，每一圈螺旋需要在每一条左手螺旋的胶原链内，每一
7、圈螺旋需要3个氨基酸残基。胶原螺旋的螺旋度不象个氨基酸残基。胶原螺旋的螺旋度不象-螺旋螺旋那么高。胶原螺旋的左手性，以及胶原的许多刚那么高。胶原螺旋的左手性，以及胶原的许多刚性源于许多脯氨酸残基的立体限制。胶原分子的性源于许多脯氨酸残基的立体限制。胶原分子的末端含有非螺旋部分，这一部分似乎对纤维形成末端含有非螺旋部分，这一部分似乎对纤维形成过程中胶原分子的正确排列以及交联是必需的过程中胶原分子的正确排列以及交联是必需的。p 典型的胶原螺旋在任一圈的第典型的胶原螺旋在任一圈的第3个位置上都含有个位置上都含有甘氨甘氨酸酸残基。胶原的特点是具有重复的残基。胶原的特点是具有重复的-Gly-X-Y-序列
8、，其序列，其中中X常常是常常是脯氨酸脯氨酸，而，而Y是是4-羟脯氨酸羟脯氨酸，它是脯氨酸的共，它是脯氨酸的共价修饰衍生物。脯氨酸和价修饰衍生物。脯氨酸和4-羟脯氨酸的总和占胶原分子羟脯氨酸的总和占胶原分子中残基数的四分之一。除了中残基数的四分之一。除了4-羟脯氨酸外，羟脯氨酸外，5-羟赖氨酸羟赖氨酸也常出现在胶原分子中。也常出现在胶原分子中。p 一条链上的每一组一条链上的每一组-Gly-X-Y-中的甘氨酸残基的酰中的甘氨酸残基的酰胺氢原子都能与一个相邻链上的残基胺氢原子都能与一个相邻链上的残基X的羰基氧原子之间的羰基氧原子之间形成分子内氢键。脯氨酸和羟脯氨酸残基在胶原的结构中形成分子内氢键。脯
9、氨酸和羟脯氨酸残基在胶原的结构中起着至关重要的作用，这些残基的有限的构象松弛度不仅起着至关重要的作用，这些残基的有限的构象松弛度不仅可以防止可以防止-螺旋的形成，而且可以使得胶原螺旋和胶原螺旋的形成，而且可以使得胶原螺旋和胶原纤维本身显示出点刚性。羟脯氨酸残基的羟基参与形成的纤维本身显示出点刚性。羟脯氨酸残基的羟基参与形成的氢键将使胶原三股螺旋更稳定。氢键将使胶原三股螺旋更稳定。胶原分子中间部分的氨基酸排列。（a）每个第三个氨基酸残基是甘氨酸，X 和 Y通常是脯氨酸和羟脯氨酸残基，（b）甘氨酸是最小的氨基酸，（c）三股螺旋使得甘氨酸残基指轴内，而另外两个残基处于螺旋表面，（d）脯氨酸和羟脯氨酸
10、的残基与多肽链结合，增强分子的刚性。-N-C-CO-H HH-N-C-CO-H2CCH2CH2H-N-C-CO-H2CCH2CHHOH甘氨酸Gly-脯氨酸Pro-羟脯氨酸Hyp-原胶原分子二级结构原胶原分子二级结构原胶原形成原胶原形成胶原纤维胶原纤维胶原纤维电镜图胶原纤维电镜图胶原类型p在原纤维中发现了在原纤维中发现了20种胶原，其中种胶原，其中5种含量最丰种含量最丰富的胶原类型是：富的胶原类型是：nI 型胶原是骨、腱、角膜和韧带中的主要胶原，型胶原是骨、腱、角膜和韧带中的主要胶原，最高可达体内所有胶原的最高可达体内所有胶原的90%。nII 型胶原在软骨、玻璃体和脊索中形成原纤型胶原在软骨、玻
11、璃体和脊索中形成原纤维。维。nIII 型胶原与型胶原与I 型胶原并存于结缔组织。型胶原并存于结缔组织。nV型和型和VI型为异三聚体，与其他三种胶原共存型为异三聚体，与其他三种胶原共存于原纤维中。于原纤维中。p由成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、上皮细胞分泌。在由成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、上皮细胞分泌。在RER上合成，形成三螺旋之前于上合成，形成三螺旋之前于Pro及及Lys残基上进行羟基残基上进行羟基化修饰。化修饰。p羟化反应由脯氨酰羟化反应由脯氨酰4羟化酶（羟化酶（P4H）、脯氨酰）、脯氨酰3羟化酶催化羟化酶催化（P3H）。）。pVc是酶的辅助因子，是酶的辅助因子，Vc缺乏导致坏血病。缺乏
12、导致坏血病。p交联：由侧向相邻的交联：由侧向相邻的lys或或hyl残基氧化后所产生的两个醛残基氧化后所产生的两个醛基间进行缩合而成。交联后后形成不溶性纤维，原胶原呈基间进行缩合而成。交联后后形成不溶性纤维，原胶原呈阶梯状排列，电镜下可见间隔阶梯状排列，电镜下可见间隔67nm的横纹的横纹胶原的体内合成（翻译）Collagen fibril bundles:a branching assembly unit in tendon morphogenesisTEM image of collagen胶原的一般生化特性胶原的一般生化特性变性变性p胶原变性是指三股螺旋之间的氢键断裂，螺旋解胶原变性是指三股
13、螺旋之间的氢键断裂，螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质的改变开，形成单链无规则线团，因而发生性质的改变（比如粘度下降、沉降速度增加、浮力上升、紫（比如粘度下降、沉降速度增加、浮力上升、紫外吸收增加等）。加热、改变胶原溶液的外吸收增加等）。加热、改变胶原溶液的pH值或值或受有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）受有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等影响，均可使胶原变性。等影响，均可使胶原变性。p通常把通常把50%胶原分子发生变形的温度称为变性温胶原分子发生变形的温度称为变性温度度Td（denaturation temperature）。由于这）。由于这一现象和结晶的熔解相类似
14、，故又称为熔点或熔一现象和结晶的熔解相类似，故又称为熔点或熔解温度。胶原的变性温度与羟脯氨酸的含量呈正解温度。胶原的变性温度与羟脯氨酸的含量呈正相关。相关。其它生化特性其它生化特性p天然胶原除非先经尿素处理使之变性，否则不易天然胶原除非先经尿素处理使之变性，否则不易溶于碱、弱酸及一般浓的中性盐类。溶于碱、弱酸及一般浓的中性盐类。p等电点为等电点为pH7-7.8，在强碱下长时间浸渍，其等，在强碱下长时间浸渍，其等电点会下降至电点会下降至pH4.7-5.3，并伴有溶解现象。，并伴有溶解现象。p胶原不溶于水，但可溶于热水。膨润的胶原经加胶原不溶于水，但可溶于热水。膨润的胶原经加热后，会产生不可逆收缩
15、，加热至热后，会产生不可逆收缩，加热至63-65时，时，纤维长度变为原来的纤维长度变为原来的1/9，若再加热，三股螺旋，若再加热，三股螺旋分开，发生热变性，形成明胶。分开，发生热变性，形成明胶。p未变性的胶原可被酸性红染成红色，变性者则否。未变性的胶原可被酸性红染成红色，变性者则否。胶原的提取-牛肌腱胶原的制备p将湿重100克牛肌腱洗净，0.5%Tris处理后取出肌腱进行切片，用75%酒精溶液进行消毒处理，用灭菌蒸馏水冲洗后用匀浆器匀浆，再用灭菌蒸馏水洗涤。p以5000r/min离心15分钟，收集沉淀再悬浮于生理盐水中1小时。以5000r/min离心15分钟，再将肌腱悬浮至于1.5L含水果蛋白
16、酶2mg的0.05mol/l的醋酸溶液中，在4下慢慢搅拌消化72小时。以5000r/min离心15分种。p将上清液用0.lmol/l的NaOH调节pH值至中性，加入NaCl至最终浓度达2.5mol/L左右。搅拌过夜，在中性条件下进行盐沉淀。p以5000r/min离心15分种。沉淀即主要为1型胶原蛋白。p将沉淀用冷的灭菌蒸馏水作短时间洗涤，然后溶解在0.05mol/l的醋酸溶液中，以0.05mol/l的醋酸溶液作透析外液在10下透析2天，然后在PH 为7.4的含130mmol/l的NaCl溶液中透析。物理改性方法物理改性方法p通过物理手段对胶原蛋白改性有通过物理手段对胶原蛋白改性有紫外线照射紫外线照射、重度脱水重度脱水、射线照射射线照射和和热交联热交联等方法。等方法。p胶原溶液如被紫外线照射胶原溶液如被紫外线照射,将在分子间产生交联将在分子间产生交联,粘度增加粘度增加,生成凝胶。目前常用的紫外线改性胶原膜的方法是将胶原生成凝胶。目前常用的紫外线改性胶原膜的方法是将胶原膜放在铝箔上膜放在铝箔上,距离距离254 nm 紫外灯紫外灯20 cm 高度高度,照射照射15 h。对经紫外线照射的胶原膜
