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1、选择性雌激素受体调节剂对MC3T3-E1细胞生长分化的调节何陨),唐婉容I吴恙2,王璐2,游涛2(6i0106成都，成都大学医护学院：II腔医学教研室I400016重庆，重庆医科大学：附属口腔医院修复科2)摘要目的探讨选择性雌激素受体调节剂(selectiveestrogenreceptormodulator,SERM)雷洛普芬对小鼠颅顶成骨细胞MC3T3-E1分化的调节及其机制。方法体外培养MC3T3-E1细胞，10mol1.的雷洛昔芬和雌激素受体拮抗剂ICl-182780刺激细胞，另设空白对照组，24、48、72h后检测各指标。MTT法检测细胞增殖；微量酶标法检测细胞碱性磷酸酶(alkal
2、iphosphatase,A1.P)活性；实时荧光定量聚合酶链式反应(realtimequantitativepolymerasechainreaction,qRT-PC)检测细胞内B-Catenin、雌激素受体a、(estrogenreceptora,ERa、ER)mRN的表达。结果MC3T3-E1细胞分别加入107mol1.的雷洛昔芬和ICIT82780后，相对于对照组，雷洛昔芬处理组的MTT、A1.P结果增加，B-Catenin、ERa和ERBInRNA的表达增高，有统计学意义(P0.05)；ICI-182780组的MTT、A1.P结果降低，B-Catenin、ERa和ERBmRNA的表
3、达均降低，有统计学意义(P0.05)。结论雷洛昔芬可能通过上调B-Catenin、ERa和ERBmRNA的表达促进MC3T3-E1细胞的增殖分化，而ICI-182780则下调B-Catenin、ERa和ERBmRNA的表达抑制MC3T3-E1细胞的增殖和分化。【关键词选择性雌激素受体调节剂：-catenin：雌激素受体：MC3T3-E1细胞；细胞分化中图法分类号1R329.28;R336;R681.4文献标志码1ASelectiveEstrogenReceptorModulatorsstimulatesthegrowthanddifferentiationofMC3T3-E1cells：inv
4、olvementofERandwnt-cateninsignalsHeYun1,TangWanrong2,WuYang2,Wan1.u2,YouTao2(lDepartmentofDentistry,SchoolofMedicineandNursing,ChengduUniversity,Chengdu610106；2Departmentofprosthodon(ics,AffiliatedHospitalofStomatology,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing.400016China)AbstractObjectiveTbinvestigateth
5、eregulationandmechanismofselectiveestrogenreceptormodulatorraloxifeneonthegrowthanddifferentiationinMC3T3-E1cellsinvitro.MethodsMC3T3-E1cellswereculturedinvitro.Raloxifene(10-7mol1.)andestrogenreceptorantagonistICI-182780(107mol1.)wereaddedintoculturedmediumrespectively.Andtheblankcontrastgroupwasse
6、tted.ProliferationwasassayedbyMTT：TheactivityofA1.Pwasmeasured；Theexpressionsof-cateniestrogenreceptorandestrogenreceptorweredetectedwithqRT-PCR.ResultsMTT,A1.P,andtheexpressionofP-Catenin、ERaandERmRNAweresignificantlyhigherinraloxifene(107mol1.)gloupthanthoseincontrolgroup(V5thecontrol,P0.05);MTT,A
7、1.P,andtheexpressionofP-Catenin、ERaandERmRNAinICI-182780gloupwerelowerthanthoseincontrolgroup(VSthecontrol,PERaandERmRNA.Keywordsselectiveestrogenreceptormodulator;-catenin;estrogenreceptor；MC3T3-E1cells;celldifferentiationSupportedbytheChongQingYubciScienceandTechnologyCommissionIssue(Yubeifinancia
8、leducation.201132).CorrespondingauthorWuYang.E-mail:【基金项目】重庆市渝北区科委课题（渝北财教201132号）【通信作者吴恙，E-mail:骨质疏松症是绝经后妇女的常见病，与体内雌激素水平降低有关I1.雷洛昔芬（raloxifene,R1.X）作为一种第二代选择性雌激素受体调节剂，对某些组织（如骨骼）具有雌激素样作用，对另一些组织（如乳腺、子宫内膜）具有抗雌激素样作用。与雌激素替代疗法相比，雷洛昔芬既能治疗骨旗疏松症，乂可显著降低患乳腺癌、子宫内膜癌的风险性，因而成为防治绝经后骨质疏松的较为理想的药物。Wnt信号在骨质疏松方面的研究已受到广泛
9、的关注，目前被认为在成骨分化与骨量调节方面具有重要的作用。对于庞大的Wnl信号系统来说，B-catenin是介导WnI信号通路从细胞膜至胞浆再进核传递路径的枢纽分子口用。雷洛昔芬是否可以通过此途径刺激成骨细胞的增值和分化，具体的作用机制仍不十分清楚。本实验将雷洛昔芬和雌激素受体拮抗剂ICl-182780分别作用于MC3T3-E1细胞，观察它们对细胞增殖和A1.P活性的影响，同时采用qRT-PCR的方法观察细胞株中-catenin.ERa和ERB的表达情况，探讨wnt/B-catenin通路是否参与选择性雌激素受体调节剂对成骨细胞增殖的作用过程。1材料与方法1. 1细胞株及试剂MC3T3-E1细
10、胞株购至中国科学院细胞库，雷洛昔芬和IeI-182780均购至美国Santa公司，DMSO（美国Sigma公司），MTT（美国Sigma公司），碱性磷酸酶检测试剂盒（南京建成），RNA抽提试剂盒（北京百泰克），cDNA链合成试剂盒（MBI）,2PCRmastermix（康为世纪），2XSYBRreal-timePCRpremixture（北京百泰克）,引物合成由北京三博远志生物技术有限公司完成，MEM培养基（美国HyQOne公司），胎牛血清（美国HyClone公司）。1.2 仪器超净工作台（苏净集团安泰公司），CXh细胞培养箱（上海易亮医疗公司），倒置显微镜（尼康），冷冻离心机（HEMN1.E
11、生产），蛋白核酸分析仪（瑞典安玛西亚公司），DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂），凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司），荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司），的标仪（奥地利TECAN）1.3 方法1.3.1 1细胞培养小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1细胞接种于含10%胎牛血清的a-MEM培养基中，置于37C、5%CO2、饱和湿度的Ca培养箱中常规培养，每2天换液1次，每45天传代1次。1.3.2 MTT法测细胞增殖取对数生长期的MC3T3-E1细胞，0.25%胰酶消化后离心，PBS清洗、离心、重悬后细胞计数，接种于96孔板中，细胞数为4XIO3个/孔，37、5%CO2细胞培养箱内孵育
12、8h使细胞贴壁后，用不同的培养液（对照组仅加培养液，其他组加入含药培养液）分组培养：对照组：雷洛昔芬（10-7mol1.）组：ICI-182780（10-7mol1.）组。每组设5个复孔，另设调零孔。分别于继续培养的24、48、72h检测吸光度值，终止反应。每孔加入MTT（5g1.）20Ul,继续孵育4h后，弃上清。每孔加DMSO150心,振荡IOmin,使结晶物充分溶解显色后，选择49Onm波长，在酶标仪上测定各孔的吸光度值（490）。细胞增殖率=（处理组。（490）值一对照组。（490）值）/对照组。（490）值100%,细胞抑制率=（对照组D（490）值一处理组D（490）值对照组D（4
13、90）值X100%。1.3.3 微量酶标法测细胞的A1.p活性分组同1.3.2,以细胞数4X103/孔的接种于96孔板，二组给药，一组空白对照，37*C,5%Co2条件下培养72h,每24小时取细胞培养上清液采用微量酶标法操作，每组设3个复孔，另设酚标准孔和调零孔。具体步骤如下：5Ul细胞培养上清液，与50缓冲液和50W基质液混匀，37水浴15min,再加显色剂150立即混匀，于酶标仪520nm波长下测定各孔的吸光度值（520）,记录结果。A1.P活性增加率和抑制率的计算公式与MTT增殖率的和抑制率的计算公式相同。1.3.4 qRT-PCR检测B-Catenin、ERa和ERB的表达MC3T3
14、-E1细胞以3X10%nl接种于75ml的培养瓶，继续培养8h后加入药物，分组同1.3.2,分别于24、48、72h后收集各组细胞，按照试剂盒说明抽提细胞内总RNA,并用蛋白核酸分析仪测定RNA溶液的浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳可见清晰的18S、28S两条带。取IHg总RNA逆转录合成cDNA0然后，采用SYBRGreenreal-timePCR试剂盒对目的基因进行定量检测，分别取1HICDNA,上游和下游Primer各11,2XPremix12.5U1.灭菌蒸储水9.5Ul,反应体系25口1。反应条件：95,C2min,95C15s,退火15S（具体温度见表1）,72延伸40s,40个循环。PCR扩增B-Catenin、ERa、ER,以-actin为内参，通过计算阈值Ct值评估mRNA水平，Ct值用B-actin标化，采用双DE1.T法相对定量进行计算。表1基因序列及其引物基因引物序列（5-3）退火温度产物长度上游Ccatcacgacactgcataatct-catenin下游AGeCAAGAATnCACGTTTGTT59122上游CGOCnCTACAGGTCTAATERa下游GGnCnGTCAATGGTGC55257上游CTTGGTCACGTACCeCTTRCERB下游GTATCGCGTCACTCCT5S250上游TGGAATCCrGTGGCATCCATGAAAC-a
