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1、重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白-9对小鼠胚胎肝脏干细胞诱导分化影响的体外研究陈聪,罗庆，毕扬，陈肯，田雯，迭小红，曹光彪，周建武，康权(400014重庆，儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室、儿科学重庆市重点实验室、重庆市(儿童发育重大疾病诊治与预防)国际科技合作基地，m庆医科大学附属儿童医院)摘要目的探讨重组腺病毒介导的小鼠骨形态发生蛋白-9(AdV-InBMp9)诱导小鼠胚胎肝干细胞向成熟肝细胞定向分化的影响。方法将已构建的表达小鼠BMP-9、肝细胞生长因子(HGF)和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒，分别感染小鼠胚胎肝干细胞，诱导其分化，然后采用半定量PCR,Real-timePC
2、R.细胞免疫荧光、荧光素酶报告基因检测等方法检测甲胎蛋白(AFP).白蛋白(A1.B)和细胞角蛋白18(CK18)等肝细胞标志物的表达。结果半定量及Real-timePCR检测，与对照组相比，诱导7d后的BMP-9组、HGF组的AFP表达下降(P0,05),A1.B的表达明显升高(P0,05):细胞免疫荧光染色，诱导7d后的细胞胞浆内表达肝细胞特有的A1.B、CK18等蛋白，而对照组几乎无表达：荧光素酶报告基因检测，诱导Id、4d、7d的肝干细胞的A1.B表达较对照组明显升高(P0.05)结论BMP9有诱导小鼠胚胎肝脏干细胞向成熟肝细胞样细胞分化的作用，并且BVP9对小鼠胚胎肝干细胞的诱导分化
3、作用强于传统的肝干细胞诱导分化因子HGF。关键词骨形态发生蛋白9：小鼠胚胎肝干细胞；分化；重组腺病毒中图法分类号文献标志码ADifferentiationofmousefetalliverstemcellsinducedbyAdenovirus-mediatedmousebonemorphogeneticproteins-9invitroChenCong,1.uoQing,BiYang,ChenKen.TianWen，DieXiaohong,CaoGuangbiao,ZhouJianwu.KangQuan(MinistrjrofEducationKey1.aboratoryofChildDev
4、elopmentandDisorders,Key1.aboratoryofPediatricsinChongqing,ChongqingInternationalScienceandTechnologyCperationCenterforChildDevelopmentandDisorders,ChildrensHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing.40014.China.)AbstractObjectiveTbexplorethedifferentialregulationofmousefetalliverstemcellstomatu
5、rehepatocytesafterinducedbyrecombinantadenovirus-mediatedmousebonemorphogeneticproteins9(Adv-mBMP9).MethodsThemousefetalliverstemcellsinfectedbytheconstructedrecombinantadenovirusexpressingBMP9、HepatocyteGrowthFactor(HGF)、andgreenfluorescentprotein(GFP).Toinvestigatetheregulationofstemcellsdifferent
6、iation,alphafetoprotein(AFP),albumin(A1.B)andcellkeratin18(CK18)weretestedbyhalfquantitativePCR,Real-timePCR,cellularimmunefluorescenceandfluorescentelementenzymegenereport.ResultsComparedtotheGFPcontrolgroup,theexpressionofAFPinducedwithBMP9andHGF7dayslaterwasdecreasedtestedbyhalfquantitativePCRand
7、Real-TimePCR(P0,05).Onthecontrary,theexpressionofA1.Bwasincreased(P0.05).Thespecificmarkerofmaturehepatocyte,A1.BandCK18havestrongexpressionafter7daysinductionwhichweretestedbycellularimmunefluorescenceassay,andthenegativeresultwereobservedwiththeGFPcontrolgroup.TheexpressionofA1.BafterId,4dand7dind
8、uctionwithBMP9andHGFinstemcellswassignificantlyincreasedcomparedtoGFPcontrolgrouptestedbyfluorescentelementenzymegenereport(PAdv-mHGFAdv-GFP,并且同时加入5lPolybrene试剂,摇匀后放入培养箱培养，并于腺病毒感染48h后，在荧光显微镜下通过感染细胞的萤光量来确定病毒的最合适感染滴度。1.4 检测重组腺病毒介导的BMP9在感染诱导HP14-19细胞后BMP-9的表达情况确定出上述各组不同浓度梯度下感染腺病毒的最佳感染滴度后，按上述条件接种于6孔板后按相
9、同条件感染HP14-19细胞，并于诱导分化后7d提取细胞总RNA进行逆转录，按照试剂说明书操作，逆转录完成后分别以CDNA为模版扩增BMP9、HGF基因，并设置GAPDH为内参对照。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物，分析条带，检测重组腺病毒感染HP14-19细胞后BMP-9、HGF基因是否成功表达。1.5 RT-PCR.Real-timePCR检测A1.B.AFP等肝细胞特征性标志物将HP14-19细胞细胞接种于6孔板中，当细胞密度达到40席左右后，每组分别加入适宜浓度的Adv-mBMP9Adv-mHGF、Adv-GFP,同时加入10lPolybrene试剂，感染7d后，各组细胞分别加入ImlTriZOI试剂，按RNA提取试剂说明书提取细胞的总RNA,检测提取的
