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1、阿苯达嗖抑制P糖蛋白表达对耐顺钳卵巢癌细胞耐药性的影响研究何迎盈1,刘娜娜I,罗治彬2,李少林】(1.重庆医科大学基础医学院核医学教研室，400016：2.重庆市合川区人民医院肿病血液科，401520)摘要目的：研究阿苯达嘤(a1.bendazo1.e,ABZ)通过抑制人耐顺销卵巢癌SKOV-3/DDP细胞P-糖蛋白(Pg1.ycoprotein,P-gp)的表达对细胞耐药性的影响。方法：在体外，用澳化二甲嚷噗二苯四氨噗(MTT)比色法检测ABZ对SKoVMDDP细胞增殖的影响，求得抑制率为0%、25%、50%、75%所对应的ABZ浓度，并按抑制率将实验分为对照组，25%抑制浓度(0s)组、半
2、数抑制浓度(ICSO)组和75%抑制浓度(IC75)组，每组给予相应浓度的ABZ处理，并按作用时间再将每组分为12h、24h、36h亚组。按组用ABZ处理细胞，在12h、24h、36h分别用流式细胞仪检测各组细胞表面P糖蛋白(P-g1.yCoProtein,P-gp)的表达。将不同浓度的顺柏(cisp1.atin,DDP)、表阿霉素Cepirubicin,EPI)5-氟尿口密咤(5-f1.uorouraci1.,5-Fu)按照分组，联合和序贯ABZ处理细胞后，采用MTT比色法检测SKoVuDDP细胞体外增殖情况。结果：ABZ作用SKoV夕DDP细胞后使P-gp表达卜降，呈浓度和时间依赖性。联合
3、利序贯ABZ,均能降低DDP、EP1.和S-Fu对SKOVmDDP细胞的作用浓度，有浓度和时间依赖性，且联合作用优于序贯作用。结论：ABZ能在体外通过抑制SKoV-夕DDP细胞P-gp表达提高细胞对DDP、EPI、5Fu的敏感性，并能逆转细胞的耐药性。关键词：阿苯达嚏P糖蛋白耐药性EffectofA1.bendazo1.eonChemoresistancebyInhibitingP-g1.ycoproteinExpressionofCisp1.atin-resistantOvarianCancerCe1.1.sAbstractObjective:Toinvestigatetheeffectof
4、a1.bendazo1.e(ABZ)onthechemoresistancebyinhibitingP-g1.ycoprotein(P-gp)ofhumancisp1.atin-resistantovariancancerSKOVyDDPce1.1.s.Method:Invitro,effectofABZonpro1.iferationofA549DDPce1.1.swasdetectedbymethy1.thiazo1.y1.tetrazo1.ium(MTT)co1.orimetry,thenaccordingtoinhibitionconcentrations(IC)of0%,25%,50
5、%z75%todevidece1.1.sinto4groupscontro1.groupzIC25groupzIC50groupxIC75groupzmoreover,basedonABZactiontimetoinvideeverygroupinto12h,24hand36hsub-groups.Atthesettingpointsofactiontime,theP-gpexpressionofeachgroupwasdeterminedbyf1.owcytometry.Thepro1.iferationofSKoVTDDPce1.1.swasdetectedbyMTTco1.orimetr
6、yaftertreatmentwithABZcombinedandsequencewithDDEEPI,5Fu.Resu1.ts：AftertreatmentwithABZ,theexpressionofP-gpdecreasedinadose-andtime-dependentcombinedandsequencewithABZcandecreaseactionconcentrationofDDPzEPIandS-FutoSKoVTDDPce1.1.s,inadose-andtime-dependentmanner,moreover,theeffectofcombinedwasbettert
7、hansequence.Conc1.usion:ABZcou1.ddown-regu1.atetheexpressionofP-gpandincreasethesensitivityofSKoV3DDPce1.1.stoDDP,EPI,5-Fu,andreversethever.Keyword：a1.bendazo1.e,P-g1.ycoprotein,chemoresistance卵巢癌是病死率最高的妇科肿瘤，且发病率和病死率逐年上升1。虽然手术与化疗提高了五年生存率，但耐药仍是治疗所面临的难题2,且常表现为多药耐药(mu1.tidrugresistance,MDR)多数学者认为耐药卵巢癌细
8、胞高表达P糖蛋白(P-g1.ycoprotein,P-gp)3介导了卵巢癌的多要MDR4。阿苯达喋属于苯并咪嗖类(bcnzimidazo1.carbamate,BZS)抗寄生虫药物，安全低毒，至今仍在使用。国外研究发现，它可以通过抑制肿瘤细胞微管蛋臼聚合5,诱出以CaSPaSe和细胞色素C释放的凋亡，耐紫杉醇的白血病细胞CEMdEpoB300和卵巢癌细胞1A9PTX227却通讯作者,罗治彬，Te1.:,E-mai1.：对ABZ敏感。但ABZ是否能够抑制P-gp表达从而影响耐药肿瘤细胞的耐药性，目前，国内外无文献报道，是本实验研究出发点。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞系人耐顺的卵巢癌
9、SKoV-歹DDP细胞株购买于中国医学科学院肿瘤细胞库。1.1.2 主要试剂及仪器胎牛血清RMPI1640培养基购自Gibco公司ABZ购自AccuStandard公司，纯度为97.5%。MTT和二甲基亚网DMSo)购自Sigma公司。顺伯(cisp1.atin,DDP)注射液购自南京制药厂。氟尿嗑咤注射液(f1.uorouraci1.,5-Fu)购自上海旭东海普药业。盐酸表柔比星(epirubicin,EPD购自浙江海正药业。P-gp抗体(货号：557003)、同型异构体(货号：555743)购自BD公司，FACSCa1.ibUr流式细胞仪为美国BD公司产品。1.2 方法1.2.1 实验分组
10、SKOV-VDDp细胞按IX1.O=孔的密度接种于96孔板，加入含终浓度为1、2、4、8、16、32、64、128UmOI/1.的含ABZ培养液。每个浓度设3个复孔。培养24h后，加入5mgm1.MTT201.,4h后，加入1501.DMSO,酶标仪49Onm处测定吸光OD值，计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率()=(1-(实验孔OD值一空白对照孔OD值)/(阴性对照孔OD值一空白对照孔OD值)X100%.按照实验结果，将实验分为对照组、25%抑制浓度(IC25)组、半数抑制浓度(ICso)组和75%抑制浓度(IC75)组。1.2.2 流式细胞术测SKOVaDDP细胞表面P-gp的表达SKOV-y
11、DDP细胞按IXIo6/孔的密度接种于6孔板，加入培养基孵育过夜。待细胞贴壁后，按组分别加入含0.0、1.5、8.0、50.0mo1.1.ABZ的培养液,在12h、24h、36h时用胰酶消化并收集细胞，PBS轻洗2次，室温IOoorPm离心3min,弃去上清液。避光条件卜,空白孔加入201.PBS,同型对照孔加入同型对照抗体201.,对照组和实验组均加入P-gp抗体201.避光室温孵育Ih,每20min轻轻熊荡Imirb最后加入PBS至300P1.,上机检测。1.2.3 ABZ影响SKoV夕DDP细胞对DDP、EPI、S-Fu的敏感性SKoVaDDP细胞按1IO4/孔的密度接种于96孔板，培养
12、过夜。将DDP、EPkS-Fu分别溶于含0、1.5、8.0、50.0mo1./1.ABZ的培养液中，使DDP和S-Fu终浓度为5、10、20、40、80、160、320、640mo1.1.,EP1.终浓度为3.5、7、14、28、56、112、224、448HmOI/1.0待细胞贴壁后，小心吸去孔内培养基，按照分组，将配好的药液加到试验孔内，每个浓度设3个复孔。培养24h后，按照1.2.1所述方法行MTT法检测并计算细胞增殖抑制率。1.2.4 ABZ影响SKOV-歹DDP细胞对DDP、EP1.5Fu的耐药性SKOV3DDP细胞按1X10，/孔的密度接种96孔板，培养过夜。待细胞贴壁后，小心吸去
13、孔内培养基，按组分别加入含0.0、1.5、8.0、50.0mo1./1.ABZ的血清培养基。培养12h后，小心吸去孔内培养基，无菌PBS轻洗两遍，再每孔加入血清培养基培养24h,再吸去孔内培养基，按组分别加入含DDP.EPk5Fu的血清培养基。DDP和5Fu的终浓度为5、10、20、40、80、160、320、640mo1./1.,EP1.终浓度为3.5、7、14、28、56、112、224、448mo1./1.o每个浓度设3个复孔。培养24h后，按照1.2.1所述方法行MTT法检测并计算细胞增殖抑制率。13统计学方法以上步骤均重复3次，所得数据采用SPSS18.0软件进行分析，结果采用5表示
14、，样本均数差别的多重比较采用单因素多水平1.SD法方差分析，以P(33.153.94)mo1./1.因此对照组、5组、ICSo组和ICTS组所对应的ABZ作用浓度分别为:0.0、1.0、5.5、35.0mo1./1.,再按ABZ作用时间将各组分为12、24、36h3个亚组，以便横向比较。2.2 SKOVVDDP细胞膜上P-gp表达经过CeIIQuest软件拟合得出各组细胞膜上P-gp的表达，从浓度和时间依赖性两方面分析ABZ对P-gp表达的影响(表1)。ABZ作用于SKOVyDDP细胞后，实验组的P-gp表达明显下降。12h时，IC25组和IC50组P-gp表达无明显差异。24h和36h时，各
15、实验组间P-gp表达差异明显。结果说明，ABZ能够明显抑制SKOV歹DDP细胞P-gp表达，并在24h和36h时有浓度依赖性（图1、2、3）。另外，相同浓度的ABZ作用不同时间，Pgp表达都具有明显的差异性，说明ABZ抑制Pgp表达还具有时间依赖性。表1ABZ对SKoV歹DDP细胞膜上P-gp表达的影响（.Hs,%）12h(%)24h(%)36h(%)对照组94.463.2295.264.0994.401.83IC25组88.042.55a53.163.50a20.952.61aIC50组83.343.76a32.471.7Iahd10.521.48aeIC75组61.263.22ac18.832.35ahc,d4.420.62abc,d,ea:P0.05,与同一时间对照组比较；b:P0.05,与同时间5组比较；c:P0.05,与同时间IC50组比较1d:P0.05,与同组内12h时比较；e：P0.05,与同组内24h时比较。图1ABZ作用12h后各组细胞的P-gp表达b1.ankSv =OZ HoSS-v口骂g8Sp = 5SSdui/12h,Io408i S OWSS图2ABZ
