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1、还原型谷胱甘肽(Teducedglutathione,GSH)试剂盒说明书还原型谷胱甘肽(reducedglutathione,GSH)试剂盒说明书微量法100T/96S注意：正式测定之前选择23个预期差别大的样本做猜测定。测定意义：GSH是细胞内最重要的抗氧化疏基物质，在抗氧化、蛋白质疏基保护和氨基酸跨膜运输等中具有紧要作用。还原型与氧化型比值(GSH/GSSG)是细胞氧化还原状态的重要动态指标。因此，测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够特别好地反映细胞所处的氧化还原状态。测定原理：DTNB与GSH反应生成复合物，在412nm处有特征汲取峰；其吸光度与GSH含量成正比
2、。自备仪器和用品：低温离心机、水浴锅、可调整移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板和蒸储水。试剂构成和配制：试剂一：液体Xl瓶，4。C保管。试剂二：液体Xl瓶，4。C保管。试剂三：液体Xl瓶，4。C避光保管。粗酶液提取：1 .组织：依照组织质量（g）:试剂一体积（m1.）为1：5-10的比例（建议称取约0.Ig组织，加入Im1.试剂一）进行冰浴匀浆。8000g,4离心IonIin,取上清置冰上待测。2 .细菌、真菌：依照细胞数量（104个）：试剂一体积（m1.）为5001000：1的比例（建议500万细胞加入Im1.试剂一），冰浴超声波碎裂细胞（功率300w,超声3秒，间隔7
3、秒，总时间3min）；然后8000g,4,离心IOnlin,取上清置于冰上待测。3 .血清等液体：直接测定。GSH测定操作：1 .分光光度计/酶标仪预热30min,调整波长到412run,蒸僧水调零。2 .试剂二置于25。C（一般物种）或者37。C（哺乳动物）水浴中保温30mino3 .空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入201.蒸偏水，140U1.试剂二，401I1.试剂三，混匀静置2min后测定412nm吸光度A1、4 .测定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入201.上清液，140U1.试剂二，401.试剂三，混匀静置2min后测定412nm吸光度A2、注意：空白管只需要测定
4、一次。GSH含量计算公式：GSH标准曲线公式：y=l.5X(X为GSH浓度，molm1.;y为吸光值)a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下(1)按蛋白浓度计算GSH(molmgprot)=(A2Al)1.5XV样(V样XCPr)=0.667(A2Al)Cpr(2)按样本质量计算GSH(mol/g鲜重)=(A2Al)1.5XV样(V样V样总XW)=0.667X(A2Al)W(3)按细胞数量计算GSH(mol/104cell)=(A2Al)1.5XV样(V样V样总X细胞数量)=0.667X(A2Al)细胞数量(4)按液体体积计算GSH(molm1.)二(A2Al)1.5XV样V样=0.667(
5、A2ADV反总：反应总体积，0.2m1.；V样总：上清液总体积，1m1.；样：加入反应体系中上清液体积，201.=O.02m1.；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/m1.；W：样品质量b.使用96孔板测定的计算公式如下GSH标准曲线公式：y=0.75x(X为GSH浓度，Umol/m1.;y为吸光值)(I)按蛋白浓度计算GSH(molmgprot)=(A2Al)0.75XV样V样Cpr=1.334(A2-Al)Cpr(2)按样本鲜重计算GSH(mol/g鲜重)=(A2Al)0.75XV样(V样V样总XW)=1.334X(A2Al)W(3)按细胞数量计算GSH(mol/104cell)=(A2Al)0.75XV样(V样V样总X细胞数量)=1.334义(A2l)细胞数量(4)按液体体积计算GSH(molm1.)=(A2Al)0.75XV反总V样=1.334(A2ADV样总：上清液总体积，1m1.；V样：加入反应体系中上清液体积，201.=O.02m1.；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/m1.；W：样品质量，g。注意事项：1 .试剂一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。2 .Z低检出限为0.011mmol1.o
