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1、垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分别蛋白质一、试破目的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)测定能白质的分子城的原理和基本操作技术。二、试殴原理蛋白质是两性电解质，在肯定的PH条件下解禽而带电荷。当溶液的PH大于蛋白质的等电点(PI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的PH小于蛋白质的等电点时，浅白质带正电，在电场中将向负极移动；能白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形态、电场强度等。聚丙烯酰胺凝胶是由有定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本试验采纳不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝
2、胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样拈被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分别胶)时，采纳两种缓冲体系；上层胶pH=6.7-68,下层胶pH=89;TriS-HCl级冲液中的TriS用于维持溶液的电中性与pH,是缓冲配对离子；Cl是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly为跟随离子，而在pH=89时，Gly的解
3、离度增加；这样浓缩胶和分别胶之间PH的不连续性，限制了慢离子的解离度，进而达到限制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分别股后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应与电荷效应，使不同的蛋臼质在同一电场中达到有效的分别。假如在聚丙烯触胺凝胶中加入肯定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴熬子表面活性剂能使蛋白质变性，特殊是在强还原剂如硫基乙醉存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽锌完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质一SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电
4、荷最远远超过蛋白质分子原有的电荷最，掩盖了不同蛋白质问所带电荷上的若异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是：Mr=K(IObm)IogMr=1.ogK-bRm,式中Mr殁白质的分子量；IOgK截距；b斜率；Rm一相对迁移率。试触证明，馈白质分子地在15,000-200,000的范围内，电泳迁移率与分子量的对数之间呈线性关系。蛋白质的相对迁移率Rm=蛋白质样植的迁移距高/染料(澳酚蓝)迁移距离。这样，在同一电场中进行电泳，把标准蛋白质的相对迁移率与相应的蛋白质分子量对数作图，由未知蛋白的相对迁移率可从标准曲线上求出它的分子量。SDS-聚丙烯酰
5、胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、重身性好的优点，是目前一般试脸室常用的测定蛋白质分子量的方法。三、试剂与主要善材1.主要试剂1)标准蛋白混合液内含:兔内酸化酶B(MW97,400),牛血清蛋白(MW66,200),兔肌动蛋白(MW43,000),牛磷酸肝醯(MW31,000)和鸡蛋清溶菌醐(MW14,400)2)3。凝胶贮备液：丙烯酰胺(ACr)29.2g,亚甲基双丙烯酰胺(Bis)08g,加双蒸水至100mJ外包锡纸，4C冰箱保存，30天内运用。3)分别胶缓冲液(1.5mol1.):Tris18.17g,加双蒸水溶解,6mol1.HCl调pH88,定容100
6、m1.e4C冰箱保存4)浓缩胶缓冲液(0.5mol1.):Tris6.06g,加水溶解，6mol1.HCl调pH68,并定容到100mJ4C冰箱保存5)电极缓冲液(pH8.3):SDSlg,Tris3g,Gly14.4g,加双蒸水溶解并定容到100Om1.4C冰箱保存。6)10%SDS,室温保存7)质量浓度10%过硫酸钺(簇新配制)8)上样缓冲液：0.5mol/1.Tris-HClpH6.81.25m1.,甘油2m1.,10%SDS2m1.,-航基乙醉1m1.,0.1%溟的蓝0.5m1.,加蒸储水定溶至IOm1.O9)0.25%考马斯亮蓝R-250染色液：0.25g考马斯亮蓝R250,加入91
7、ml50%甲醉，9ml冰醋酸10)脱色液：50ml甲醉，75ml冰瞄酸与875ml双蒸水混合1 D未知分子量的蛋白质样品(Imgm1.)2 .试验器材DDYCZ-24D垂直板电泳槽(北京市六一仪擀厂)2) 电泳仪3) 长滴管与微随加样据4) 烧杯(250m1.、500ml)、量简(500m1.、250ml)、培育皿(15cm15cm)5) 注射器等四、试验操作1 .装板将密封用硅胶框放在平玻璃匕然后将凹型玻璃与平玻璃重登，将两块玻璃立起来使底端接触桌面，用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内，然后插入斜插板到适中程度，即可濯胶。2 .凝胶的聚合分别胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的依次与比例，配置10%
8、的分别股和48%的浓缩胶。试剂名称10%的分别股5%的浓缩胶Acr/Bis30%/ml3.30.8分别胶缓冲液（pH8.9）3.75O/mlO1.25浓缩胶缓冲液（pH6.8）0.10.110%SDSml502510%过硫酸钺ul4.052.92双蒸水/ml55TEMED/ul按上表各液加入混勾后配制成分别股后，将凝胶液沿凝胶腔的K玻墙板的内面线缓用滴管滴入，当心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上沿2cm处为止,约5m1.o然后用细滴管或注射器细致注入少成水,约0.5-Im1.。室温放置聚合30-4Omir1。待分别胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分别股表面的水分，按上表制备浓缩胶。用长滴管当心加
9、到分别胶的上面，插入样品模子（梳子）；待浓缩胶聚合后，当心拔出样品模子。3 .蛋白质样品的处理若标准蛋白质或欲分别的蛋白质样品是固体，称取Img的样品溶解于Im1.0.5molZ1.pH68Tris-盐酸缓冲液或蒸储水中；若样品是液体，要测定蛋白质浓度，按1.01.5mgm1.溶液比例，取蛋白质样液与样品处理液等体积混匀。本试验所用样品为1520g的标准蛋臼样品溶液，放置在05m1.的尚心管中，加入15-201的样品处理液。在100t水浴中处理2min,冷却至室温后备用。吸取未知分子做的蛋白质样品201,依据标准蛋白的处理方法进行处理。4 .加加SDS-聚丙郁帙胺疑胶垂直板型电泳的加样方法用手
10、夹住两块玻璃板,上提斜插板使其松开,然后取下玻璃胶室去掉密封用硅胶框,留意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力,再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽,插入斜板,将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上,外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm处即可,留意避开在电泳槽内出现气泡。加样时可用加样器斜靠在提手边缘的凹槽内，以精确定位加样位置，或用微盘注射器依次在各样品槽内加样，各加10151（含蛋白质1015g）,稀溶液可加20301（还要依据胶的厚度敏捷驾驭）。5 .电泳加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进股前电流限制在1520mA,大约1520min;样拈中的澳酚蓝指示剂到达分别胶之后，电流升到3
11、045mA,电泳过程保持电流稳定。当溟酚蓝指示剂迁移到距前沿l2cm处即停止电泳，约1-2小时。如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。6 .染色、脱色电泳结束后，关掉电源，取出坡璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入铜丝作为标记，放入大培育皿中染色，运用025%的考马斯亮蓝染液，染色24h,必要时可过夜。弃去染色液，用蒸懈水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，常常换脱色液，直至蛋白质带清舱为止。7 .结果处理1）测量脱色后凝胶板的K度和每个蛋白质样品移动距离（即蛋白质带中心到加样孔的距斑），测量指示染料迁移
12、的跑离。2)按以卜.公式计算蛋白质样品的相对迁移率(Rm)相对迁移率=样品迁移距离(Cm)/染料迁移距离(Cm)3)标准曲线的制作：以各标准蛋白质相对迁移率为横坐标，蛋白质分子量的对数为纵坐标在半对数坐标纸上做图，得到一条标准曲线。4)测定蛋白质样品的分子量：依据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上杳得该蛋白质的分子最。五、1 .聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳的几个不连续性是什么？2 .电泳时的三个物理效应是什么？是怎样造成的？3电泳后上下槽缓冲液可否混合后再运用？为什么？4 .上样缓冲液中加入甘油的作用是什么？5 .贮液配制与贮存应留意什么？6 .过硫酸镀、7%乙酸和考马斯亮蓝在试验中有什么作用？附：不同分别股的配制方法分别股的浓度20%15%12%10%7.5%双蒸水/ml0.752.353.354.054.851.5mol1.2.52.52.52.52.5Tris-Hcl(pH8.8)ml10%SDSml0.10.10.10.10.1凝胶储备液6.65.04.03.32.5(Acr/Bis)/ml10%过硫酸钺ul5050505050TEMED/ul55555总体积/ml1010101010
