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1、（一）试验前应明确的问题1 .选择适当的细胞接种浓度C般状况下，96孔培育板的内贴壁细胞长满时约方105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预试验检测其贴壁率、倍增时间以与不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试胶中每孔的接种细胞数和培育时间，以保证培育终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌玷与细胞数醇的线性关系否则细胞数太多敏感性降低，太少视察不到差异。2 .药物浓度的设定。肯定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。依据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细籁C切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。3 .时间点的
2、设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最终得到不同时间点的抑制率改变状况，画出改变的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应当就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。4 .培育时间。2003的培育液对于10的45次方的增殖期细胞来说,很难维持68h,假如养分不够的话，细胞会由增殖期慢慢趋向GO期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的C5MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞肯定数.做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的上升。6 .理论未必都是对的。要依据H己的实际状况调整。7 .试验时应设置调零孔，比照孔，加
3、药孔。调零孔加培育基、MTT.二甲基亚碉。比照孔和加药孔都要加细胞、培育液、MTT、二甲基亚碉，不同的是比照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。8 .避开血清干扰。用含15%胎牛血清培育液培育细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光汲取值。由于试验本底增加，会试脸敏感性。因此，一股选小于10%胎牛血清的培育液进行。在呈色后，尽景吸净培育扎内残余培育液。二）试珍步H贴壁细胞：1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100U1,铺板使待测细胞调密度至1000-10000I1.,（边缘孔用无菌PBS填充）。2.5%CO2,37C孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药
4、物,原则匕细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天卜午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔1003,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实状况.3.5%CO2,37孵育16-48小时，倒置显微镜卜视察C4每孔加入20UlMTT溶液（5mgml,即05%MTT）,接着培育4h若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培育液，当心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培育液。5 .终止培育，当心吸去孔内培育液。6 .每孔加入150Ul二甲基亚硼，置摇床上低速振荡Iomin,使结晶物充分溶解。在酣联免疫检测仪OD490nm处测砧各孔的吸光值。7 .同时设置调零孔（培育基、M
5、TT,二甲基亚邮，比照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培育液、MTT、二甲基亚网）悬浮细胞：D收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度lX106m,按次序将补足的1640（无血清）培育基40Ul;（2）JActinomycinD（有莓性）IouI用培育液稀释需预试找寻最佳稀释度，1:10-1:20）;需检测物IOul;细胞悬液50ul（即5104cellf1.）,共100Ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设比照（加100?（储存液1001640）o2）置37C,5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下视察。3）每孔加入10ulMTT溶液（5mgml,即05%MTT）,接着培育4h。（悬
6、浮细胞举荐运用WST-1,培育4h后可跳过步骤4）,干脆胸联免疫检测仪OD570nm（63Onm校准）测肽各孔的吸光值）4）离心（100O转XlOmin）,当心吸掉上清,每孔加入100Ul二印基业他，置摇床上低速振荡IOmin,使结晶物充分溶解。在前联免疫检测仪OD570nm（63Onm校准）测电各孔的吸光值。5）同时设置调冬孔（培育基、MTT、二甲基亚碉），比照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培育液、MTT、二甲基亚根），每组设定3复孔。（三）MTT的配制MTT一股最好现用现配，过滤后4匕避光保存两周内有效，或配制成5mgml保存在-20度长期保存，避开反豆冻融，最好小剂砧分装，用避光袋或
7、是黑纸、锡箱纸包住避光以免分解.我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，干脆往培育板中加，没必要一卜.子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就肯定不能再用了。MTT有致癌性，用的时候当心,有条件最好带那种透亮的薄膜手套.配成的MTT须要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，终归时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉“配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60C水浴助溶。PBS配方:Nacl8g,Kcl0.2g,Na2HPO41.44g,KH2PO40.24g,调ph7.4,定容11.。（四）关于钢廊的接种（，板）细胞过了30代以后就不要用了,因
8、为状态不好了;培育板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预试验。接种时最好依据预试族操索出的密度接种，因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。假如铀的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡,因为细胞长的太快养分会不够，最终导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不隹。故而MTT细胞密度多采纳10000/ml,100UI/孔。细胞密度要依据不同细胞的特点来定.假如你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，假如你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度
9、，这样与比照的区分更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104.（五）加入MTT个人认为MTT最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的MTT的适当比例，详细细胞数目和真正起作用的的MTT之间的关系的确不好确定，我认为MTT多加一些比少加好一些MTT的各家报道不同,一般是过M的,所以IoUl即够了.假如不运用96孔板,培育基超过100ul,MTT依据10%的比例加入力I入MTT以后振荡一卜让MTT与培育基混勾,不过这个应当关系不大。如加入MTT后都有个别孔马上变为蓝黑色，则污染的可能性椀大,另外MTT稀释接加入细胞前谡是须要以谩液的方式i成菌23宜.且在加M
10、TT前可以先在镜卜.视察，看看是否有孔染菌，染菌的孔经常是接近的。因为血清中白蛋白对大部分的药物都才结合效应，所以可以单独将药物和MTT加在一起，看会不会起反应。假如不起反应，就不用去除含药物的培液，干脆加MTT即可。首先说说我的一点阅历：1 .吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液城的3到4倍，可能比较简单混勾。IOml的离心管里面最好装34ml的悬液：悬液太少简单吹起许多气泡，悬液太多又不简单吹成单细胞悬液。2 .吸管的吸液猿最好在Iml左右：吸液成过多的活，一下吸起许多液体，管中所剩就很少，这样吹打简单起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不匀称。假如是吸液Iitlml多的吸管，总液
11、盘在5ml左右为益3.吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则简单吹打出气泡。4吹打次数100左右，就可以吹打匀称了（花人认为加细胞而吹打30-50次基本就差不多匀称了。加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次，每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟，然后再以肯定的速度吸取悬液。）5.向每孔中用枪头加入细胞时不要太快,否则你会发觉细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集堆，一般都在孔的底部中心，而周边很少,这种不匀称的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中，向左3F,向右3F,在来回回复3下移动，目的是使得细胞能分
12、散的匀称些。（铺板技术是MTT试酷的关键，也是基础，肯定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞，最终细胞全死了，建汉不要采纳这种方法混勾细胞。其它的声音：1 .首先细胞的接种密度肯定不能过大，一般每孔100o个左右就够了，我认为宁少勿多。尤其是对于肿痛细胞。100O0/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。2 .MTT本身就是比较粗的试炊，增殖率10%左右的波动都不算惊奇。特殊是新手，2。%的波动也是常见的，所以很可能是技术缘由引起的，特殊是种板技术肯定要过关。3 .我做的是肿瘤细胞的MTT试验,这种细胞K的很快一
13、起先我是用100000/M1.的浓度来接种的,结果细胞长的太满结果是没花梯度也没方线性关系.后来调整浓度,用过4000080000M1.的浓度都做过MTT试验,结果发觉做的结果比较好点的是6000070000M1.的浓度组的.用40000/M的浓度的组,由于细胞少,药物作用的梯度还是有,只是没有很好的线性关系.还有依据细胞生长速度以与药物的特性（有时间依能性和浓度依除性的药物）来确定培育时间是48小时还是72小时.留意细胞悬液肯定要混匀，已避开细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数地不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要娴熟，尽最避开人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是假如操作不熟，CV会在8%左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要娴熟些、快些上板。
