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1、病毒的分离培养标准操作规程病毒的分离培养标准操作规程1 .目的：规范病毒分离及鉴定培养操作流程，保证试验结果的重复性和稳定性。2 .术语：EID500.1mlfE1.D5OO.lml,TCID500.1ml,CPE3 .操磔序与方法：3.1 采样：对于病死或剖杀动物，采集病毒主要聚集组织部位，一般为淋巴结、脾脏、肺脏、血液等；对于活体动物，可用无菌棉拭子采集含病毒量最多部位（口腔、月腔、生殖道、肛门等）的分泌液.采集样品如不能立即处理，应冻存与-20备用.长途运输应用冰盒或4低温保存.3.2 样品处理：组织块可用剪刀剪碎并研磨，加入10倍体积含300-500UIml青、链毒索的生理盐水（PBS
2、）,反复冻融2-3次。棉拭子可直接混于3-5倍体积含300-500ImlW,链霉素的生理盐水（PBS）,反复冻融2-3次。8000rpm离心15min,取上清液用022m滤膜过滤，透过液即为病毒原液，收集保存，短期保存4,长期保存用液氮.33接种培养：将病毒原液接种与特定细胞单层中，连续盲传4-6代，观察细胞是否产生特异性CPE,并计算及TQD50/0.：1.m1.禽源类病毒可接适当日龄鸡胚或鸡胚成纤维细胞进行扩增和鉴定，并计算及EID500.1ml和E1.D500.1mlo3.4 病毒纯化：采用有限梯度稀释法结合噬斑纯化法对病毒进行纯化；3.5 动物回归实验:分离培养并纯化好的病毒回归接种动物，观察动物病变是否为该病毒引起及病变特征是否典型。3.6 分子生物学鉴定：基因组提取并设计特异性引物，对分离病毒保守区基因片段进行特异性扩增，并测序，从分子水平对其进行鉴定。3.7 血清学鉴定:用标准阳性血清与分离病毒作用一段时间后再次接种特异性细胞或鸡胚验证病毒特异性.或者用荧光标记抗体与病毒作用后荧光显微镜下观察其特异性.4 .注意事项4.1 采样过程应做好自身防护，烈性病不得随意分离.4.2 实验动物应及时焚烧或深埋等处理，避免病毒扩散到环境中。4.3 纯化好毒种应及时做好扩毒并建立毒种库。1
