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1、AG490在膀胱癌中的抗癌效应及其机制AG490在膀胱癌中的抗癌效应及其机制作者：姚林方，叶章群，陈志强，刘冠琳，孔德波，杨为民【摘要】目的视察JK2激酶抑制剂AG490对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其抗癌机制。方法应用不同剂量AG490处理膀胱癌细胞系BIU87,台盼蓝排斥试验检测细胞活力，嘎理蓝比色试验检测细胞增殖，克隆形成试验进一步检测膀胱癌细胞系干细胞对药物的敏感性，Hoechst33258Pl荧光双染检测细胞凋亡特征，流式细胞仪检测营细胞周期和凋亡,WeSt吹ernblot检测pJ眼AK2、STAT3、p刊STAT3、CyclinDKbclx1.蛋白表沮达水平；并建立膀胱癌荷瘤
2、且模型，视察AG490体内钿抗肿痛作用。结果AG490明显抑制膀胱癌细胞增殖散和干细胞克隆形成，使细胞还周期阻滞，促进膀胱癌细胞盹凋亡：并可使pJAK2芸、STAT3、pSTA超T3、CyclinDK+bclx1.蛋白表达水平明显下降.裸鼠移植痛在A5G490的作用下明显缩小.结论AG490通过阻断STT3信号通路，抑制错膀胱癌细胞的增殖，促进其X调亡。【关键词】膀胱洒癌；AG490；信号通路：抗癌效应TheMec慷hanIsmofAntiJCanCerEffeCtSofJanusKinaSeInhibitorA穗G490inlIumanB间IadderCancer龟Abstract：Obje
3、ctiveToi茁nvestigatetheanticancereiSffectsofjanu徘sKi11aseselet11Ctiveinhibit来orAG490inhumanbladderTh绸ebladdercanc餐ercellIineBI良U87wastreat菩edwithAG490i胄ndifferentdo洌ses.ThecellvitalityandprOliferationw羸eredetectedb汆yTrypanBIues迪tainingrejec蒲tion,celIcou徘ntIngandMTTa忸ssay.Drugsen缤SitiVityOfbl仰addercan
4、cers诂IemcellstoAGX490wasdetect柑edbycIoneformationcounti伽ngassay.Fluorescencedyes妹tuffHoechst3viii3258andPIdou诀blestaining糊assaywasused蛆toinvestigatethecelIapoptosischaract锂eristics.Flo褪Wcytometrywa镇SaPPIiedloan括alyzethecel1Cycleandapop1tosis.Theexpressionsofph晾Osphorylatio说nSpecificJA超K2(pJAK2),S肃TA
5、T3,phosphorylationspe擂cificSTT3(pSTT3),Cycl均inDIandbclX-1.weremeasuredbywesternA睽G490couIdrcm检arkablyinhib:IttheprolifeCrationofbladdercancercel绥Isandtheform晌ationofthetumorstcmcelIc澡Iones,blockt憬hecel!cycle,灵facilitatetheapoptosisofbladdercance莫reelIs,andre痔suiti11lessex蹄PressionofpJK2,STT3,pWSTT3,
6、CyclinF)IandbclA班G490showedst+rongabiIitie苑Sofinhibitin尹gtheprolifer敦ationofbladd叨ercancercell芫sandinducingIhEirapoptos筋iSthroughbIo室CkingtheSTAT绪3signaIingpathway.Keywofirds：Bladderc粟ancer；AG490：蔽Signalingpathway；AnticancereffectsO*引言膀胱癌是我国泌尿系最常见的恶性肿瘤，发病率居泌尿系肿瘤首位，至今殖仍无特异的抗癌药物。信号傲转导和转录激活因子3(S芭ignalt
7、ra11sdu饺Cerandactiva汹toroftranscr芸iption3,STTBS3)信号通路是当前细胞因嗪子探讨领域的热点，该通路钮异样活化与细胞异样增殖和郑恶性转化亲密相关。而STAT3信号通路的异样活化棍源于JK2激曲的异样激曝活。探讨发觉JAK锹2激的抑制剂AG490可猾特异性阻断STAT3信号推通路，抑制肿痛细胞生长，备在白血病治疗方面显示良好1.的抗肿瘤效应2。我们利用体外细胞培育技术和体陶内移植瘤模型，视察了AGB490对膀胱癌细胞增殖和邺凋亡的影响，了解AG49韩0在膀胱癌中的抗癌效应，骸并进一步探讨其抗癌机制。钮1材料与方法材料少膀胱癌细胞系BIU8腴7购H武汉高
8、校中国典型培武养物保藏中心，用含10%悒胎牛血清的完全RPMl卜1640培育液，在37-C邈、5%C02培育箱中培育酷。氨基N芳苯乙烯轲胺（AG490）购自美国菇Calbiochcm公司瞠o胰蛋白根、唾嘿蓝（MT业T）、二甲基亚碉（DMS0）、双苯并咪哇染料（Hoechst33258）灵和碘化丙喔（PD均购闩肋美国SIGMA公司。An荼nexinVFITC凋惶亡检测试剂盒购自晶美生物力工程有限公司。Westernblot采纳一抗和碱御性磷酸筋标记的二抗。BA辉1.B/c裸小鼠（nun妞U）购自中科院上海试验动咏物中心，均为雄性，46韦周龄，体重1822g.方法台盼蓝排斥试葵验细胞经不同浓度AG
9、翳490处理24、48和7糙2h后，制成单个细胞悬液,取9滴细胞悬液移入小试管中，加1滴S台盼蓝溶液0混匀，在3min内用血球计数板分别计数活细胞和死辞细胞数，活细胞率盘）=病活细胞总数/（活细胞总数诃+死细胞总数）】00%MTT法细胞接种俅于96孔板中，贴壁后无血V清培育24h,使细胞同步化。按上述方法处理细胞，分别培育24、48和72h后，每孔加入MTT溶液舅201,接着孵育4h,挂终止培育，吸尽孔内上清。每孔加入150IDMS转0,振荡IOmin,在胸联免疫检测仪上测定570三nm波特长光汲取值。细胞钊抑制率=IO0%。戕克隆形成试验制备单个璧细胞悬液，作梯度倍数稀释逸，按每皿300个细
10、胞接种地于培育皿中，细胞同步化和竖G490处理同前，更换撷完全培育液接着培育2周后,用PBS浸洗2次，甲醉三固定后，加适量姬姆萨染色r,浸洗干燥，计数克隆数。做50个细胞以上的集落算一滦个克隆，克隆形成率=克隆呗数/接种细胞数100%啜Hoechst332郸58/PI荧光双染在际6孔板中铺板爬片，细胞同焕步化和AG490处理同前悄，加入Hoechst33锁2581001,37匕衬避光反应IOmino接着钾加入PllOOI,4C避光反应20min,4%乖多聚甲醛固定细胞IOmin后，置于荧光显微镜下观濠察细胞形态结构及胞核的变贩化，每张玻片随机选择10仙个视野并计数，区分出坏死滔、凋亡和活细胞，
11、并计算出篓凋亡率、坏死率及存活率。撵细胞周期检测细胞接芒种于6孔板，细胞处理同上是，收集细胞，PBS洗涤，Y70舟冰乙醉固定，PI染色，应用FACSort流帝式细胞仪进行检测，数据用橘美国BD公司CellQu花esl细胞周期分析软件进钧行储存及分析。细胞凋亡检测用4预冷的P暄BS洗细胞2次，用250啪1结合级冲液重悬细胞，戒使其浓度为H06m睁1。取1001的细胞悬尹液于5ml流式管中，加入铭51AnnexinV苫FITC和IoIPl溶现液，混匀后于室温避光孵育缩15min,再加入400V-IPBS,上流式细胞仪逐检测。Western仄blot法参照美国Sa楠ntaCruz公司供应的蚓方法提取
12、蛋白。以Brad+ford法作蛋白定量后，制取50g蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分别后，粽电转移至硝酸纤维素膜，3全7C封闭Ih后，分别加入倘1：1000稀释的一抗p痂JAK2、STAT3、pSTAT3、CyclinDKbclX1.后巷4C过夜，加入碱性磷酸的值标记的二抗检测杂交蛋白。膊体内移植瘤抑制试验制备细胞悬液接种于裸鼠背部，每个部位注射（含5熬106个活细胞），当瘤块靖成形，直径达时，即将动镂物随机分组，比照组腹腔注一射生理盐水，试验组腹腔注翠射AG490oG490每5mg用ImlDMSO+19mlddH20充分溶解，每次腹腔注射IOm精g/kg体重。以上两组均蝴隔口注射1次，4天测
13、肿瘤辩体积1次，用药21天颈椎参脱位处死裸鼠，完整剥离瘤体，分别称量病重。计算瘤诿体积=长宽2,单位c入m3,抑瘤率（盼=（1用药组平均瘤重/阴性对械照组平均瘤重）100%统计学处理数据以楮s表示，组间比较采纳两样蜉本均数的t检验，应用统计徭软件包进行统计学分析。镇2结果台盼蓝阳排斥试验和MTT试验结果闵见图1、20随着G490药物浓度增大和作用时间换的延长，BIU87细胞仿活力不断下降，AG490对细胞的抑制率不断增加，细胞增殖明显受到抑制，而饕相应空白比照组改变不明显衷，差异有统计学意义。作用72h后，不同浓度（25葡、50、100moli1.）的AG490对BW贤87细胞的抑制率分别为堑
14、%、M%.克隆形成恁试验进一步检测膀胱癌细胞皮系干细胞对药物的敏感性，爹见表Io可见随着G494.0药物浓度的不断增大，B荔IU87干细胞克隆数明丕显削减，克隆形成率从先降至%。不同浓度（25、5颁0.100mol1.）筱的G490对BIU8铢7细胞克隆形成的抑制率分朦别为舟、%、%,表IA枷G490对BIU87干互细胞克隆形成的影响与空白比照组比较，*P与空白辖比照组比较，*P流式细胞凋亡检测发觉AG490笆明显促进BlU87细胞的早期凋亡，见表4。10锵OmOI/1.AG490呢作用72h后，细胞早期调影亡率由%增加至先,具有显腓著性差异。表4流式细胞分析检测细胞早期凋亡与舵空白比照组比较
15、，*P膀竿胱癌细胞接种于裸鼠皮下1谋周后，可见背部成形的瘤块耦，移植胜利率为100%。IfG490组与阴性比照组琨比较，其肿痛生长速度显著俣减慢，见图4o用药21天助后处死全部裸鼠，测抑瘤率个为治3探讨STAT3信号通路是调控细胞增抢殖、分化及渊亡的重要的细憨胞内信号通路。JAK2作最为上游激醉活化后募集胞浆倍中的STAT3单体，使无活性的STT3分子酪氨孟酸磷酸化而形成有活性的二喻聚体，转移入细胞核，结合幡DNA,导致特定靶基因的钉开后3o近年来探讨发现，该通路持续激活可导致季细胞异样增殖和恶性转化，嚷参加了人类恶性肿瘤的发生三、发展和演进4O越来读越多的肿瘤细胞系和人类癌骷组织表达异样活化的STA楷T3蛋白5。阻断该通N路成为肿瘤治疗的新靶点训6目前，已经发觉AG醯490是该通路的特异性阻锹断剂。G490即富的基N节苯乙烯胺，是盗一种人工合成的苯亚甲基丙二精的脂类衍生物，分子式为C17H14N203,分子量为，结构类似酪氨酸赵，可以和受体酪氨酸激酶竞争结合位点，是JAK2激沟酶抑制剂，可特异性阻断S趣TAT3信号通路。目前，AG490作为抗肿苓痛药物已用于临床治疗向血髓病，特殊是对JAK2异样削活化导致的前B急性淋巴细膛胞白血病具有很好的治疗作篙用，同时毒副作用很小2宝在本试验中，我们应杯用G490
