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1、试验一、血涂片的制备和染色【原理】将一小滴血液匀称涂在玻片上，呈单层紧密分布，制成薄血片。用含天吉B和伊红的Romannowsky类染料进行染色。细胞中的碱性物质如RBC中的血红蛋白与嗜酸性粒细胞胞质中的嗜酸性颗粒等与酸性染料伊红结合染成红色；细胞中的酸性物质如淋巴细胞胞质与喑碱性粒细胞质中的嗜碱性颗粒等与碱性染料亚甲蓝结合染成蓝色；中性粒细胞的中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染成淡紫红色，【器材】1裁玻片运用前，必需细致清洗，并用乙醇或软布清洁。2 .推片选择边缘光滑的栽玻片，在两角分别作斜线标记，然后用玻璃切割刀裁去两角，制成约15mm宽度的推片。3 .吸耳球。4 .显微镜5 .酒
2、精灯。6 .采血针。7 .注射器和针头。【试剂】1 .瑞氏(Wright)染液(1) I液:包含瑞氏染料1.0g,纯甲醇(AR级以上)60OmI、甘油15m1.。将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醉渐渐地研磨(至少30min),以使染料充分溶解.再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒入干净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲繇细研，如此多次研磨.直至染料全部溶解，甲重用完为止。再加15m1.甘油密闭保存。(2) H液：磷酸盐缓冲液(pH6.46.8),包含磷酸二氢钾(KH2PO4)0.3g、磷酸氢二钠(Na?HPOJ0.2gx蒸储水加至10m1.o配好后用磷酸盐溶液校正pH
3、,塞紧瓶口贮存。如无缓冲液可用簇新蒸僧水代替。2 .吉姆萨染液包含吉姆萨染料0.75g、甘油35m1.、甲醇65m1.。将吉姆萨染料、甘油和甲醇放入含玻璃珠的容器内，每天混匀3次，连续4天，最终过滤备用。3 .瑞-吉复合染液(1) I液：包含瑞氏染料1g、吉姆萨染料0.3g、甲准500m1.、中性甘油IOmI。将瑞氏染料和吉姆萨染料贵干净研钵中，加少量甲醇，研磨片刻，再吸出上液.如此连续几次，共用甲醇500m1.。收集于棕色玻璃瓶中，每天早、晚各摇3min.共5d,以后存放1周即能运用。(2) I1.液削磷酸盐缓冲液(pH6.46.8).包含无水磷酸二氢钾6.64g、无水磷酸氢二钠2.56g,
4、加少量蒸锵水溶解.用磷酸盐调整pH,加水至1.0m1.o【操作】1 .采血(1)静脉采血法：用EDTAK抗凝12h内的标本，运用玻棒、毛细管、注射针头等在距载玻片一端Icm处加1滴抗凝血，直径约4mm。(2)皮肤采血法：选择第三、四手指，并先采红细胞、白细胞计数.再采血1滴置干净玻片上用于血涂片制备。2 ,制作涂片左手平执载玻片，或放在类似桌子等平坦地方,右手持推片从后方移动接近血滴，使血液沿推片边缘绽开，将推片与载玻片呈30。45。角,用匀称速度向前将血液推成厚薄相宜的血涂片，血涂片应呈舌状，头、体、尾三部分，且清晰可见。全部血液必需在推片到达末端前用完。推大于一片血片。贫血病人推片速度要快
5、。3 .干燥涂片空气干燥：快速干燥。4 .标记涂片在载玻片的一端用记号笔编号，注明患者姓名或门诊/住院号。5 .染色(1)瑞氏染色法：待血涂片干透后，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢.然后将玻片平置于染色架上，滴加染液(I液)35滴，使其快速盖满血涂片，约0.5Imin后，滴加等量或稍多的缓冲液(11液)，轻轻摇动玻片或用吸球对准血涂片吹气，使染液充分混合。5IOmm后用流水冲去染液，待干。(2)吉姆萨染色法：将固定的血涂片置于被pH6.4-6.8磷酸盐缓冲液稀释1020倍的吉姆萨染液中,浸染1030min(标本较少可用滴染)。取出用流水冲洗，待干燥后显微镜检查。(3)瑞一吉复合染色法：操
6、作步骤同瑞氏染色法.只是染色时将瑞一吉复合染液I液和H液替代瑞氏染液的I液和I1.液。6 .视察结果将干燥后的血涂片置显微镜下视察。用低倍镜视察血涂片体、尾交界处的血细胞。在显微镜下，成熟红细胞染成粉红色；血小板染成紫色；中性粒细胞胞质染成粉红色，含紫红色颗粒；嗜酸性粒细胞含大的桔黄色颗粒；嗜碱性粒细胞胞质含有大量深紫蓝色颗粒；单核细胞胞质染成灰蓝色；淋巴细胞胞质染成淡蓝色。视察后显微镜擦拭。【留意事项】1 .瑞氏染液簇新配制的染液偏碱，染色效果较差，经在室温下贮存肯定时间，美蓝渐渐转变为天青B后方可运用，这一过程称染料成熟。放置时间愈久，天青B愈多,染色效果愈好，但必需盖严瓶口,以免甲醇挥发
7、或氧化成甲酸。甲醉必需用AR(无丙酮)。染液中也可加中性甘油3m1.,防止甲醇挥发，使细胞染色较清晰。2 .采血(1)不能采集以下部位的血液：示指或拇指血液。2感染部位血液，如甲沟炎。3耳垂部位血液，含单核细胞太多C(2)不能运用肝素抗凝标本。(3)玻片必需清洁、干燥、无尘。新玻片：应在清洁液中浸泡过夜，然后用水冲洗，最终用蒸储水冲洗。已用过的玻片：应在60C。清洁液中加热20min,然后用水冲洗，最终用蒸福水冲洗。3：边缘破裂、表面有划痕的玻片不能再用。(4)运用玻片时，只能手持玻片边缘，切勿触与玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。3 .制作涂片很多因素可影响血涂片的厚度，针对不同
8、患者应有的放矢，对血细胞比容高、血粘度高的患者应采纳小血滴、小角度、慢推；而贫血患者则应采纳大血滴、大角度、快推。涂片质量不佳可能缘由不规则间断和尾部太长有空洞白细胞和血小板尾部分布不规则涂片太长或太短涂片没有尾部涂片很短涂片没有边缘空隙有细胞退变现象血涂片厚白细胞破损推片污染、推片速度不连续、裁玻片太脏裁玻片污染脂肪、油脂制片技术差推片角度不佳血滴太大血滴太小推片太宽固定延迟、固定时间太短、甲醇污染血滴大、血粘度高、推片角度大、推片速度快推片时用力过猛4 .干燥涂片血涂片干透后方可固定染色.否则细胞尚未坚固地吸附在玻片上,在染色过程中简单脱落。5 .染色步骤(1)操作留意事项与操作不当的后果
9、见表1-3。操作留意事项操作不当的后果加染液应适量过少则易蒸发沉淀，一旦染料沉积在血涂片上，则不易冲洗，使细胞深染不易检查。冲洗时不能先倒掉染液，应染料镇静在血涂片上以流水冲洗冲洗时间不能过久脱色冲洗完的血涂片应立放于支剩余水分浸泡脱色架上(2)染色时间与染液浓度、室温与细胞多少有关。染液淡、室温低、细胞多则染色时间要长；反之，可削减染色时间。必要时可增加染液量或延长时间。冲洗前,应先在低倍镜下视察有核细胞是否染色清晰.核质是否分明。应当在详细实践中摸索合适的时间，特殊是在更换染液时。每批染色液和缓冲液，均需试染，以便驾驭染色时间和加缓冲液的比例。6.结果视察低倍镜下视察血涂片应厚薄相宜.细胞
10、不重叠，头尾与两侧有肯定的空隙.一些体积大的特殊细胞常在血涂片的尾部出现。如有可能，干燥后的血涂片先用中性树胶封片后再视察，不仅能长期保存血涂片，而且视察效果更佳。染色效可能缘由订正措施果太蓝涂片太厚、冲洗时间太短、中性水在含1%硼酸的95%乙静溶PH太高、染色时间太长、稀释染液冲洗2次，用中性水冲洗,液重复运用、贮存染液暴露于阳光待干镜检太红冲洗时间太长、中性水PH太低、规范操作。簇新配置中性水。贮存染液质量不佳、涂片干燥前加保证染液质量不佳封片太淡染色时间太短、冲洗时间太长复染。应先加缓冲液，后加染液，或加染液与缓冲液的混合液，不行先加染液染料沉染料沉淀、染液未过滤、涂片太脏用甲建冲洗2次
11、、并马上用水冲掉甲帝，待干后复染蓝色背固定不当、涂片未固定贮存过久、留意涂片的固定。运用EDTA景运用肝素抗凝剂抗凝静脉血试验二、白细胞计数与分类计数原理：用白细胞稀稀液将血液稀释肯定的倍数，同时破坏溶解红细胞。将稀释的血液注入血红细胞计数板，在显微镜下计数肯定体积内的白细胞数，经换算即可求出每升血液中的白细胞数量。器材：显微镜、改良牛鲍计数板、试管、吸管微量吸管、滴棒,试剂：白细胞稀释液操作：1、加稀释液用吸管吸取白细胞稀释液0.38m1.于小试管中2、吸取血液用微量吸管吸取筑新全血或末稍血20u1.,擦去管尖外部余血。将吸管插入小试管中白细胞稀释液的底部，轻轻放出血液，并吸取上层白细胞稀释
12、液清洗吸管23次。3、混匀将试管中血液与稀稀液混匀,待细胞悬液完全变为棕褐色。4、充池再次将小试管中的细胞悬液混匀。用滴棒慈取细胞悬液1滴，充入改良NeUbaUer计数板的计数池中，室温静置23min,待白细胞完全下沉。充两个池双份计数取平均值。5、计数在低倍镜下计数四角4个大方格内的白细胞总数。6、计算：白细胞=41020106=201071.留意事项：1、稀释用吸管、微量吸血管、血红细胞计数板均为计量工具，运用前需经过严格的校正.否则将干脆影响计数结果的精确。2、运用标本可为由静脉搏穿刺实行的簇新全血,也可为静脉末梢血。采集末梢血时，应留意采血部位不得有冻疮、水肿、发纣、炎症等，以免标本失
13、去代表性；同时也应留意不能过度挤压,以免组织液混入引起血液凝因或造成计数结果不精确。3、在充池时，如充液不足、液体外溢、断续充液，或产生气泡、充液后移动盖坡片等，均会使细胞分布不匀称，造成计数结果不精确。4、计数池内的细胞分布应匀称，一般状况下各大方格间的细胞数相差不超过1。机若相差太大，应重新充池。5、计数大小方格内的压线细胞时，遵循数上不数下、数左不数右的原则。6、白细胞数母过多时，可采纳加大稀释倍数的方法，留意区分杂质和白细胞。分类计数：原理：将血液制成细胞分布匀称的血涂片，用瑞氏染液染色，依据各类细胞的形态特点和颜色差异将白细胞进行分类并计数。通常分类100个白细胞，计算得出各种白细胞
14、所占的百分率。器材：显微镜、分类计数器、香柏油、拭镜纸、清洁液。试剂：瑞氏染液、磷酸盐缓冲液操作：1、染色将血涂片用瑞氏染液染色，冲洗干净，自然干燥后待用。2、低倍镜视察低倍镜下视察白细胞分布和染色状况。3、油镜视察选择血涂片体尾交界处细胞分布匀称、着色良好的区域，按肯定的方向依次对所见的每1个白细胞进行分类，并用白细胞分类计数器作好记录，共计数100个白细胞。4、计算求出各类细胞所占的百分率留意事项：1、由于各种白细胞体积大小不等，体积较小的淋巴细胞在血涂片的头、体部较多，而尾部和两侧以中性粒细胞和单核细胞较多，因此分类最佳区域为体、尾交界处。2、分类时要有秩序地、没肯定方向连续地进行.既不
15、重复亦不遗漏.避开主观选择视野。3、分类计数结果的记录也可采纳手工画“正”或+”的方法。试验三、红细胞计数原理：稀释液将血液稀释肯定倍数，充入计数池后，在显微镜下计数肯定体积内的红细胞数量.经换算求出每升血液中的红细胞数量。器材：微镜、改良牛鲍记板、试管、微运吸管、玻璃棒。试剂：细胞稀释液操作：1、加稀释液取小试管1支，加红细胞稀释液2m1.。2、加血用清洁干燥微量吸管采集末稍血或抗凝血IOU1.擦去管外余血，轻轻加至红细胞稀释液底部，再轻吸上清液清洗吸管23次.马上混匀。3、充池混匀后用微星吸管或坡璃棒将红细胞悬液充入计数池，室温下平放35min,待细胞下沉后于显微镜下计数。4、计数用高倍镜依次计数中心大方格内4角和正中5个中方格内的红细胞数。5、计算红细胞/1.=NX5X：1.OX1.oA200=NX101.o=100XIO12N：表示5个中方格内数得的红细数。X5：将五个中方格红细胞数换算成1个大方格红细胞数。X1.0：将1个大方格红细胞数换Iu1.血液内红细胞数。10c：I1.=IOcU1.
