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1、附件3：分离培养构体方法I培养基制备方法1.1 Korthof培养基成分和制得方法1.1.1 成分蛋白腺(可用胰蛋白腺代替)40Omg氯化钠(NaC1.)700mg氯化钾(KCI)20mg碳酸氢钠(NaHCo3)IOmg磷酸二狙钾(KH2PO4)I2mg碳酸氮二钠(12个结晶水XN2HCO3.12H2O)44()mg氯化钙(CaCI2)20mg(如而压灭菌或煮沸后出现沉淀，可省去此成分)蒸一水5(X)m1.1.1.2 制法1.1.2.1 将以上成分溶了蒸储水中煮沸20min过源校正PH为7.2,分装丁烧瓶内,每瓶100m1.15磅30min高压灭菌。1.1.2.2 兔血清56C30min灭活。
2、1.1.2.3 将1.1.2.1液以无菌操作加入灭活仇血清最后浓度为810%。1.2 TcpckHH培养基(璘酸部缓冲溶液)成分和制备方法母液1.15mo1.1.Na2HPO4.1.2H2O12g500m1.蒸谯水磷酸缓冲液1./15mH，1.KH2PO44.5g/5(N)m1.蒸储水取1.15mo1.Na2HPO4.1.2H2O80m1.1./1.5mo1.1.KH2PO420m1.混匀，调整pH7.27.4,加入蒸储水900m】混匀,分装试管，并用15磅30Inin高压灭菌,再以无菌操作加入灭活兔血清最后浓度为810%。2培养分离病原体2.1 病人血液培养：采集早期病人血液，无菌操作接种于
3、2-3管KOrthOf培养管中,每管接种I3滴。血培养管置28C培养。杼隔57d取培养物暗视野显微镜卜.观察有无钩端螺旋体生长，若有生长，即为分离阳性。若未见生长，需继续培养6(k1.仍不见钩端螺旋体方作阴性处理。2.2 病人尿液培养：接取病后两周以上的病人中段尿3O5On1.于无菌离心管中35004000rmin离心1.h。取沉渣O.3O5m1.接种于2-4管上述培养基中，28C我育。每隔57d取材镜检。为提高检出率和减少污染，可在采集尿标木的前一天晚上给病人服碳酸氢钠(NaHCO3)24g,同时，在培养基中加入1.(X)-400gm1.5-藏腺晚噬或1.2(XX)的磺胺嗜晚。23动物灯脏培养：无菌操作，采集新鲜动物肾脏(包膜完整)，剪取米粒大小接种于23管KCrIhOf培养管中。理28匕培养。每隔57d取培养物暗视野显微镜下观察有无钩端螺旋体生.长，若有生长，即为分离阳性。若未见生.长，需继续培养60d,仍不见钩端螺旋体方作阳性处理。3.落株分群、分型：应用分群血清与新分离的钩端螺旋体作凝集试验，确定菌群。应用交叉凝集素吸收试验或分型因子血清来确定的型。
