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1、第七章生产菌种的扩大培育与保藏目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按百分之十左右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。要从保臧在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产用种子是一个由试验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长的快慢；产狗子力量的大小；及对养分、温度、需氧等条件的要求均有所不同。因此，种子扩大培育应依据菌种的生理特性，选择合适的培育条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设施采用率提高。种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。种子扩大培育:是指将保
2、存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培育而获得肯定数量和质量的纯种过程。这些纯种培育物称为独壬。发酵工业生产过程中的种子的必需满意以下条件：（1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能快速生长，迟缓期短；（2）生理外形稳定；（3）菌体总量及浓度能满意大容量发酵罐的要求；（4）无杂菌污染；（5）保持稳定的生产力量。第一节种子的制备过程在发酵生产过程中，种子制备的过程大致可分为两个阶段:（1）试验室种子制备阶段（2）生产车间种子制备阶段E6r杵Fr大公讣汽S冏I-砂士Ik子；e一右:K干燥君子；&-语自次4一平瓶价.味恰技停工一妹孑珞扑
3、面心讣：&一三办均不必筠界；7*s-Hz）U-常蚌始一、试验室种子的制备试验室种子的制备一般采纳两种方式：对于产狗子力量强的及狗子发芽、生长繁殖快的菌种可以采纳固体培育基培育抱子，抱子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产泡子力量不强或狗子发芽慢的菌种，可以用液体培育法。（一）抱子的制备1,细菌抱子的制备细菌的斜面培育基多采纳碳源限量而氮源丰富的配方。培育温度一般为37。细菌菌体培育时间一般为12天，产芽泡的细菌培育则需要510天。2,霉菌抱子的制备霉菌抱子的培育一般以大米、小米、玉米、数皮、麦粒等自然农产品为培育基。培育的温度一般为2528。培育时间一般为414天。3,放
4、线菌抱子的制备放线菌的抱子培育一般采纳琼脂斜面培育基，培育基中含有一些适合产抱子的养分成分，如戴皮、豌豆浸汁、蛋白陈和一些无机盐等。培育温度一般为28。培育时间为514天。（二）液体种子制备1,好氧培育对于产泡子力量不强或抱子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（5.griseus）产卡那霉素的卡那链霉菌（S.Kanamuceticuss）可以用摇瓶液体培育法。将抱子接入含液体培育基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培育，获得菌丝体，作为种子。其过程如下：试管一三角瓶一摇床一种子罐2,厌氧培育对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其种子的制备过程如下：试管一三角瓶一卡式罐一种子罐例如生产啤酒的酵母菌一
5、般保存在麦芽汁琼脂或MYPG培育基（培育基配制：3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克蛋白月东，10克葡萄糖和20克琼脂与升水中）的斜面上，于4冰箱内保藏。每年移种34次。将保存的酵母菌种接入含IOml麦芽汁的500-IOOOmI三角瓶中，再于25C培育23天后，再扩大至含有250-500ml麦芽汁的500-100Oml三角瓶中，再于25培育2天后，移种至含有5-1OL麦芽汁的卡氏培育罐中，于1520C培育35天即可作IOOL麦芽汁的发酵罐种子。从三角瓶到卡氏培育罐培育期间，均需定时摇动或通气，使酵母菌液与空气接触，以有利与酵母菌的增殖。二、生产车间种子制备试验室制备的抱子或液体种子移种至种子罐
6、扩大培育，种子罐的培育基虽因不同菌种而异，但其原则为采纳易被菌采用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，假如是需氧菌，同时还需供应足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培育液中匀称分布，获得相同的培育条件。1,种子罐的作用：主要是使抱子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能快速生长，达到肯定的菌体量，以利于产物的合成。2,种子罐级数的确定种子罐级数:是指制备种子需逐级扩大培育的次数，取决于：（1）菌种生长特性、泡子发芽及菌体繁殖速度；（2）所采纳发酵罐的容积。比如：细菌:生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。茄子瓶一种子罐一发酵罐霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵抱子悬浮液一一级种子
7、罐（27,40小时抱子发芽，产生菌丝）一二级种子罐（27C,1024小时，菌体快速繁殖，粗大菌丝体）一发酵罐放线菌:生长更慢，采纳四级发酵酵母:比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子3,确定种子罐级数需留意的问题（1）种子级数越少越好，可简化工艺和掌握，削减染菌机会（2）种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会（3）虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如转变种子罐的培育条件，加速了胞子发芽及菌体的繁殖，也可相应地削减种子罐的级数。其次节种子质量的掌握一、影响布子质量的因素及掌握影响泡子质量的因素通常有：培育基、培育条件、培育时间
8、和冷藏时间等。1,培育基生产过程中常常消失种子质量不稳定的现象，其主要缘由是原材料质量波动。例如在四环素、土霉素生产中，配制产抱子斜面培育基用的熟皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对抱子质量的影响也不同。蛋白陈加工原料不同如鱼陈或骨膝对抱子影响也不同。原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机离子含量不同，如微量元素Mg2+、Cu2+.Ba2+能刺激抱子的形成。磷含量太多或太少也会影响抱子的质量。水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。菌种在固体培育基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，消失的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。解决措施:（1）培
9、育基所用原料要经过发酵试验合格才可使用；（2）严格掌握灭菌后培育基的质量；（3）斜面培育基使用前，需在适当温度下放置肯定时间；（4）供生产用的泡子培育基要用比较单一的氮源，作为选种或分别用的培育基则采纳较简单的有机氮源。2,培育条件（1）温度温度对多数品种斜面泡子质量有显著的影响。如土霉素生产菌种在高于37。C培育时，狗子接入发酵罐后消失糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般各生产单位都严格掌握胞子子斜面的培育温度。（2）湿度制备斜面抱子培育基的湿度对抱子的数量和质量有较大的影响。例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌，胞子制备时发觉：在北方气候干燥地区抱子斜面长得较快，在含有少
10、量水分的试管斜面培育基下部抱子长得较好，而斜面上部由于水分快速蒸发呈干疤状，泡子稀有。在气温高含湿度大的地区，斜面抱子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利于抱子的形成。从表中看出相对湿度在40%45%时泡子数量最多，且抱子颜色匀称，质量较好。表7/不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响相对湿度（）斜面外观活抱子计数（亿/支）16.5-19上部淡薄、下部稠略黄1.225-36上部薄、中部匀称发白2.340-45一片白，抱子丰富，稍皱5.73,培育时间和冷藏时间（1）培育时间一般来说，年轻的抱子不如年轻的刑子，由于年轻的胞子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于年轻的泡子会导致生产力量的
11、下降。解决措施:抱子培育的时间应当掌握在他子量多、抱子成熟、发酵产量正常的阶段终止培育。（2）冷臧时间斜面冷藏对抱子质量的影响与抱子成熟程度有关。如土霉素生产菌种抱子斜面培育4天左右即于4C冰箱保存，发觉冷藏78天菌体细胞开头自溶。而培育5天以后冷藏，20天未发觉自溶。冷藏时间对徇子的生产力量也有影响。例如在链霉素生产中，斜面抱子在6冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%,冷藏3个月后降低35%。4,接种量接种量大小影响到培育基中狗子的数量，进而影响菌体的生理状况。二、影响种子质量的因素及掌握生产过程中影响种子质量的因素通常有：泡子的质量、培育基、培育条件、种龄、接种量。1,培育基种子培
12、育基要满意以下要求：（1）养分成分适合种子培育的需要（2）选择有利于抱子发芽和菌体生长的培育基；（3）养分上要易于被菌体直接汲取和采用；（4）养分成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高（5）养分成分要尽可能与发酵培育基相近。2,培育条件(1)温度(2)通气量在种子罐中培育的种子除保证供应易被采用的培育基外，有足够的通气量可以提高种子质量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充分和不足两种状况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。3,种龄种龄:是指种子罐中培育的菌丝体开头移入下一级种子罐或发酵罐时的培育时间。
13、通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培育时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产力量下降，菌体自溶；种龄太短,造成发酵前期生长缓慢。不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种试验来4,接种量接种量:是指移入的种子液体积和接种后培育液体积的比例。接种量的大小打算于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采纳较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可削减杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培育时间，降低发酵罐的生产率。14C
14、lE3n蠢800、LI1It13679接种显（）接种运对靛性生H诲产生的影响通常接种量，细菌15%,酵母菌510%,霉菌715%,有时2025%三、种子质量的掌握措施种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产力量。因此首先必需保证生产菌种的稳定性，其次是供应种子培育的相宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。因此在生产过程中通常进行以下两项检查。（1）菌种稳定性的检查（2）无（杂菌）检查四、种子质量标准1,细胞或菌体菌丝形态、菌丝浓度和培育液外观（色素、颗粒等）单细胞：菌体健壮、菌形全都、匀称整齐，有的还要求有肯定的排列或形态；霉菌、放线菌：菌丝粗大、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝
15、分枝状况和内含物状况好。2,生化指标种子液的糖、氮、磷的含量和PH变化。3,产物生成量在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，由于种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产力量和成熟程度。4,酶活力种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有肯定的关联。五、种子特别分析菌种生长速度，过快或过慢菌丝结团菌丝粘壁第三节实例一、谷氨酸发酵的菌种扩大培育斜面菌种一一级种子培育一二级种子培育一发酵罐L斜面菌种的培育菌种的斜面培育必需有利于菌种生长而不产酸，并要求斜面菌种肯定纯，不得混有任何杂菌和噬菌体，培育条件应有利于菌种繁殖，培育基以多含有机氮而不含或少含糖为原则。(1)斜面培育基组成葡萄糖0.1%,蛋白陈1.0%,牛肉膏1.0%,氯化钠0.5%,琼脂2.02.5%,pH7.07.2(传代和保臧斜面不加葡萄糖)。(2)培育条件3334C,培育1824h2,一级种子培育一级种子培育的目的在于大量繁殖活力强的菌体，培育基组成应以少含糖分，
