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1、O.05$环胞素滴眼液稳定性的长期试验考察1 .前言环抱素(Cyc1.osporine,CS)是一种其曲源性、由I1.个妖基酸组成的亲脂性环状多肽类物质，也是一种高效免按抑制剂。它广泛地应用于器官移植和多种自身免疫性疾病的治疗中U1.也是国际上认可的可以治疗干眼症的处方药。其药理作用主要通过选择性、可逆性地抑制T淋巴细胞而实现，通过转导作用，作用于T细胞活化过程中信号，抑制神经钙蛋白，进而抑制T细胞增长与分化，最终达到免疫抑制效果。在临床上多用于治疗器官移植后的免疫排斥反应、类风湿性关节炎等自身免疫疾病，并且可提高存活率。环电素用手眼表疾病也具有显著的疗效。其在眼科的应用分为全身用药和局部用药
2、两种方式。然而全身用药受到血-眼屏障等因素不易进入眼内.并且会带来严重的不良反应，因此多为眼局部用药。角膜移植排斥反应是由供体角膜的特殊抗原引起的一种炎性反应。环泡素作为种强效免疫抑制剂，可有效抑制角膜移植后的免疫排斥反应阴，在临床的治疗方面仍以做皮质激素和环抱素为主，但是长时间应用激素公产生多种不乩反应。环抱素抑制T细胞由G)期向G1.期转变，从而抑制T淋巴细胞的抗原呈递并抑制白介素2和r干扰素的产生，减轻术后的排斥反应。蚕蚀性角膜溃疡又名Mooretfs溃疡，是一种慢性、进行性、痛痛性角膜涉疡，初发于角膜周边部位，沿角腴周边部延伸，并向角膜中央制行发展，最终累及全角膜。术后常规应用激素和环
3、抱素滴眼液及环磷酰胺等免疫抑制剂药物治疗。该术后药物维持治疗研究结果同证明局部环抱素滴眼液单独或联合板层角膜移植术可以有效治疗难治性蚕饨性角膜溃疡。腺病毒感染引起的流行性角膜结膜炎(EPidemiCkeratitisconjunctivitis,EKO是种世界性广泛流行的眼部传染病，但可通过自身免疫系统的建立，很快自愈。其临床特点是急性浇泡性或假膜性结膜炎，伴有角膜上皮下浸润，常由免疫反应所引起。通常需要历时一定时间才会吸收，长达数月、甚至数年渍疡不会形成，如果瞳孔区发生了病变,定会对该病人的视力造成的伤害较为严重。Jengw等报道应用环抱素联合糖皮质激素点眼对其进行治疗较为理想，应用环电素进
4、行治疗会显得更加有效、安全、无副作用。此外，环抱素多用于治疗临床中常见的干眼症(DES)IU1.干眼症多为种更杂原因所致泪液质和量及动力学的异常从而导致泪膜不稳定性和或眼表面异常、并伴有眼部不适症状的一类疾病。在临床方面用药效果较好，可以有效缓解干眼等不适症状,且不良反应小，可以长期使用干眼症又名角结膜干燥症(KCS),是因为眼表汨液减少.黏液分涎异常等原因引发的汨液蒸发较多，分布异常的综合征。其大致可分为四种类型:由于泪腺功能低下所致的水样夜缺乏性干眼病；由于沙眼、化学伤所致的黏性蛋白缺乏性干眼病；由于眼睑缺损、配带角膜接触镜等导致泪液分布不均匀而引起泪液动力学异常：由于睑板腺功能障碍引起脂
5、肪缺乏性干眼拉：在普通人群中的发病率为0.3第2】，干眼症的治疗应着手于去除病因，减少眼表和泪腺的炎症，改善泪膜的结构和功能。DES的发病率与多种因素有关，其中50岁以上女性患病率约为男性的2倍。在某些疾病中，其发病率更高，如在糖尿病患者和风湿性关节炎患者中分别为54.31和46.7津支环苑!素滴眼液疗效好，且无全身性不良反应，近年来在欧美国家临床得到了广泛应用，对于斯耶格伦氏综合征(SjorgmnsSyndrOmC)这类与炎症相关的干眼症，可使用环抱素等消炎药进行治疗U*.各类临床试验也证明，使用环布素滴眼液能增加患者眼汨量。环的素较人造眼泪的疗效要好，某些患者经人造眼泪治疗数月无效，但使用
6、环抱素后效果显著，且增强了患者角膜及结膜知觉的敏感度患有家族性淀粉样多发性神经病变的患者，通过环例素治疗后干眼症状明显减轻，且无任何不良反应IUi1.环胞素的作用是有效缓解慢性干眼症潜在的炎症过程，局部应用环抱素能阻止某些患者干眼进程，对治疗干眼症有良好的疗效。滴眼剂是眼病治疗常用途径。环抱素具有脂溶性，易溶石植物油中，现如今环抱素的眼用剂型为普通乳剂型滴眼剂。由于环抱素的相对分子质量大且呈疏水性，眼内通透性差，难以达到治疗水平，影响疗效。微乳(microeniukion,ME)系指粒径为101.00nm的乳滴分散在另一种液体介质形成的热力学稳定的胶体溶液。微乳一般在一定条件下可自发(或轻度振
7、摇)形成，其乳滴多为大小比较均匀的球形，呈透明或半透明状。微乳是由油相、表面活性剂(SF),助表面活性剂(CoSF)以及水相组成的，在一定温度长时间放冏或高心(1300rmin.30min)均较稳定。我们按照中国药典关于溶液颜色检杳法的方法、澄清度检查法以及制剂稳定性指导原则的要求对该制剂的稔定性进行长期试验考察.按药物制剂稳定性盘点考察项目，考察滴眼液性状、可见异物、含量、PH值、有关物质及无菌情况。为0.05阂环胞索滴眼液的生产、包装、贮存、使用条件提供科学依据。2仪器与试药2.1仪器数显无极恒速搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）日本岛津产1.C1.oAVP型高效液相色谱仪SPd-IOAVP型
8、紫外检测器1.C-IOAVP泵CTO-IOAVP柱温箱C1.ass-up工作站Shim-packvp-ODS色谱柱（15Omm*4.6mm）日木岛津产紫外分光光度计UV-2450（天津市津腾实验设备仃限公司）（梅特勒托利多仪器有限公司）（梅特勒-托利多仪器有限公司）（CB1.Photoe1.ectronTechno1.ogyCo.1.id.）（天河医疗仪器有限公司）（天津市双吉色谱仪器经营部）（浙江京环医疗用品有限公司）隔膜真空泵GM-0.33电子分析天平AG135实验室pH计FE20Mode1.C3860超声仪渗透压摩尔浓度测定仪SMC30B针头式微孔滤膜过海器次性使用无菌注射器灯检装置A.
9、带有遮光板的H光灯光源B.不反光的黑色背景：C.不反光的白色背景和底部D.反光的白色背景（指遮光板内侧）。药品光照试验箱公司）调温调湿箱2.2试药环抱素温度XMTA908光照强度XMTA808（重庆汉胞仪器有限（天津天宇机电有限公司）环抱素对照品大豆油聚乙二静PEG400聚山梨酯80羟苯乙酯甲醇乙脯（福建科瑞药业有限公司,批号：140201（N）（中国药品生物制品鉴定所，含量为98.法）（新兴（铁岭）药业有限公司,批号：15050106201）（江西益普生药业有限公司，批号：20141（X）1）（四川金山制药有限公司,批号：150502）（广州市广谱医药有限公司，批号：141102）（色谱纯，
10、天津市康科德科技有限公司）（特级品，天津市康科德科技有限公司）磷酸（化学纯，石家庄市试剂厂翼都化学试剂有限公司）水为纯化水三乙胺为分析纯0.05冏;泡素滴眼液3制三批：160203160204.160205）色谱用试剂为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为注射用水.3方法3.1 样品的制备：取羟聚乙酯0.3g加入70Om1.纯化水,加热使之溶解,加入60m1.聚乙二醇-400,搅拌，混匀：取0.5g环抱素至乳钵中,加IOm1.大豆油，80m1.聚山梨丽80,充分研磨，倒入上述溶液中，快速搅拌,加纯化水至100Om1.,混匀，045Pn1.微孔滋膜过滤，无菌分装，即得。3.2 色谱条件及方法学研尢：3
11、.2.1 色谱条件：色谱柱:Shim-PaCkVP-ODS色谱柱（150mm*4.6mm流动相：乙胭：甲醉：水：三乙胺（2:600：2:0.5）,用磷酸调PH到2.93检验波长：2IOnm柱温：65流速：1.2nWmin进流fit：饱和进样进样量：201.3.2.2 样品预处理.：取U8固相萃取小柱两个，串联使用并将其活化（活化顺序为：甲醉-水-水一甲醉，每次各5m1.）,用5m1.的移液管精密吸取样品5m1.至小烧杯中，用注射器全部吸取并缓慢打入小柱，收集滤液，用注射器二次吸取完全，再次通过小柱，弃去滤液，后用5m1.纯化水冲洗杂质,再用乙脑、水的混合液（1：1）洗脱样品于IOm1.的容量瓶
12、中定容，混匀。过滤（孔径045m）,作为供试品。3.2.3 系统适应性实验：用移液管精密量取该样品5m1.,按照322的处理方法操作，再321的色谱条件下进样，记录色谱图，计算理论塔板数，分离度,比较标准品、样品和空白微乳的色谱图。3.24标准曲线的绘制：精密称取环抱素对照品25mgT50m1.容Si瓶中，用乙脂溶解并稀择至刻度使成储备液。再分别精密移取储备液3,4,5,6,7m1.于IOm1.容量瓶中，用乙脑稀释至刻度，配成01.502025.03035gm1.的溶液，并按上述色谱条件分别进样，记录对应的峰面积.以峰面积（Y）与对照品浓度（X）回归，观察其是否呈良好的线性关系，计算其回归方程
13、。3.3制剂稳定性的长期试验考察：331溶液的性状：本品为淡黄色澄明液体。照中国药典溶液颜色检杳法，配制黄绿色调标准比色液。分别取6C2C条件卜.，于0月，1月，2月，3月的环抱素滴眼液样品直接与标准比色液比较，样品与标准色体积相等，同置口色背景前，平视观察.3.3.2鉴别在含量测定项卜.记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间与对照品主峰的保用时间分别一致。333无菌情况的检测：取本品005i环的素滴眼液，采用薄膜过滤法处理，用0.%无菌蛋白陈水溶液冲洗（每膜不少于100m1.）,以金黄色前荀球菌为阳性对照菌，依照法检查（中国药典），应符合规定。33.4pH和渗透压的检查:本品PH值应在506.
14、5之间，渗透用摩尔浓度应在290430mOsmOVkg范国内.分别取6C2C条件下O月,1月,2月,3月的005%环抱素滴眼液样品适量，测定其PH值、渗透压并观察制剂理化性质是否稳定。335可见异物检查：分别取6C2C条件下O月，1月，2月，3月的环电素滴眼液样品20支，去除容器标签，把容器外壁清洁干净，调节光照度至200030001x,将供试品置于遮光板边缘处，并在人眼的清晰观测距离内（约为25cm）,分别置于黑色和白色背毋下，手持供试品颈部轻轻旋转和翻转容器使药液中可能存在的可见异物悬浮（但应避免产生气泡），轻轻翻摇后即用日检视，玳豆3次，总时限为20秒。样品制剂在静置一定时间后轻轻旋转时
15、应无烟雾、状微粒柱，且没有检出金属屑、玻璃屑、长度或最大粒径超过2mm的纤维和块状物等明显可见异物：也没有检杳出微细可见异物（如点状物、2mm以下的短纤维和块状物等，根据检测结果，观察该0。5生环泡素滴眼液样品的可见异物检查是否符合标准。336样品含量的测定：取0.05%环抱素滴眼液样品，按照322样品预处理方法项下操作，供试品201.进样，使用外标法根据峰面枳计算样品的含量，要求该制剂含环抱素（C62HiuNuOG的含量应在90%1.1.0%的范用内。3.3.7有关物痂检测：分别取6C2,C条件下O月，I月，2月，3月的0.05%环刑素滴眼液样品适量，进行精密称定。按照322的操作步骤完成样品预处理后，然后用乙脑定容，制成每Im1.中含O.25mg的溶液，作为供试品溶液：同理制成每Im1.中约有2.5g的溶液，作为对照液。照含量测定项下的色谱条件，取对照液201.注入液相色谱仪，调节灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满员程的20精密量取供试品溶液与对照品溶液各201.,分别进样，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，供试品溶液色谱图中，单个杂质峰面积不得大于对照液主峰面枳的力Io(0.7%),测得的各个杂质峰面枳之和不得大于对照液主峰面积的1.5倍(1.5%),按照处方制
