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1、第三章第三章 微生物反应器操作微生物反应器操作一、微生物培养过程根据是否要求供氧的分类：n厌氧培养：不通氧的深层培养n好氧培养：液体表面培养 通风固态发酵 通氧深层培养第一节第一节 微生物反应器操作基础微生物反应器操作基础二、通氧深层培养分类(1)分批式操作（分批式操作（batch operation, batch fermentation）n 底物一次性加入反应器内，在适宜条件下接种进行反应，反应完成后将全部反应物取出的操作方式。n是目前发酵制品生长采取的主要操作方式。(2)反复分批式操作（反复分批式操作（repeated batch operation）n是指分批操作完成后取出部分反应系，
2、剩余部分重新加入一定量的基质，再按照分批式操作方式反复进行。(3)半分批式操作半分批式操作n半分批式操作(semibatch operation)也称流加式操作(feedbatch operation)。n是指先将一定量基质加入反应器内，在适宜条件下接种使反应开始。反应过程中，将特定的限制性基质按照一定要求加入到反应器内，以控制罐内限制性底物浓度保持一定，当反应终止取出反应物料的操作方式。n酵母、淀粉酶、某些氨基酸和抗生素等常用操作方式。(4)(4)反复半分批式操作（反复半分批式操作（repeated semibatch repeated semibatch opertionopertion）
3、 n是指流加操作完成后，取出部分反应系，剩余部分重新加入一定量基质，再按流加操作方式进行，反复进行。(5)(5)连续式操作（连续式操作（continuous continuous operationoperation）n是指在分批式操作进行到一定阶段，一方面将基质连续地供给到反应器中，另一方面又把反应液连续不断地取出，使反应条件（如反应液体积等）不随时间变化的操作方式。n活性污泥法处理废水、固定化微生物反应等多采取连续式操作。第二节第二节 分批发酵法分批发酵法 n 发酵工业中常见的分批方法是采用单罐深层培养法。n每一个分批发酵过程都经历接种，生长繁殖，菌体衰老进而结束发酵，最终提取出产物。n这
4、一过程中在某些培养液的条件支配下，微生物经历着由生到死的一系列变化阶段，在各个变化的进程中都受到菌体本身特性的制约，也受周围环境的影响。一、分批发酵的特点一、分批发酵的特点n微生物所处的环境是不断变化的；n可进行少量多品种的发酵生产；n发生杂菌污染能够很容易终止操作；n当运转条件发生变化或需要生产新产品时，易改变处理对策；n对原料组成要求较粗放。（一）延滞期延滞期n把微生物从一种培养基中转接到另一培养基的最初一段时间里，尽管微生物细胞的重量有所增加，但细胞的数量没有增加。这段时间称之为延滞期。n 延滞期细胞特点：延滞期细胞特点：n细胞本身面临着一系列的变化，如pH值的改变、营养物质供给增加等。
5、因而，延滞期的微生物主要是适应新的环境，让细胞内部对新环境作出充分反应和调节，从而适应新的环境。n从生理学的角度来说，延滞期是活跃地进行生物合成的时期，为将来的增殖作准备。延滞期长短对发酵结果的影响延滞期长短对发酵结果的影响n种子培养基和培养条件必须合适，只有这样才能获得高的产量。n接种后延滞期的长短关系到发酵周期的长短，而与产物形成速率和产率并无必然联系。n实际生产过程中，为缩短发酵周期、提高设备利用率、提高体积生产率，就必须尽可能地缩短延滞期。延滞期长短的因素延滞期长短的因素n接种材料的生理状态，如果接种物正处于指数生长期，则延滞期可能根本就不出现；n培养基的组成和培养条件也可影响延滞期的
6、长短。n接种物的浓度对延滞期长短也有一定影响，加大接种浓度可相应缩短延滞期。n解决途径：n一是尽量选择处于指数生长期的种子；n二是扩大接种量。但是，如果要扩大接种量，又往往需要多级扩大制种，这不仅增加了发酵的复杂程度，又容易造成杂菌污染，故而应从多方面考虑。不同营养对发酵酒精废液的米曲霉种子品质和形态的影响 （二）（二）指数生长期指数生长期n对细菌、酵母等单细胞微生物来讲，单位时间内其细胞数目将成倍增加。n而对于丝状微生物而言，单位时间内其生物量将加倍。n此时，如以细胞数目或生物量的对数对时间作一对数图，将得一直线，因而这一时期称作指数生长期。 指数生长期细胞特点指数生长期细胞特点n细胞保持均
7、恒生长。n不断吸收培养基中的营养成分以合成自身物质，并不断向培养基中分泌代谢产物。n由于此时培养基中的营养成分远远过量，且积累的代谢产物尚不足以抑制微生物本身的生长繁殖，因而微生物的生长速率不受这些因素的影响，而仅与微生物本身的比生长速率及发酵液中的生物量浓度X(g/L)相关。 对于单细胞的微生物来说，还可进一步简化为N培养基中的细胞密度。对于特定的微生物而言，其比生长速率只与三个因素有关。限制性营养物质的浓度、最大比生长速率m、底物相关常数Ks。假定营养物质进入细胞后，立即被利用而不积累，则存在以下关系式： n如果各种营养物质均大大过量的话，则=m，这时便是指数生长期。也就是说，处于指数生长
8、期的微生物，其生长繁殖不受营养物质的限制，因而具有最大比生长速率。n如果发酵的目的是为了获得微生物菌体的话，则应尽量设法维持指数生长期。 微生物的最大比生长速率在工业上的意义微生物的最大比生长速率在工业上的意义n为保证工业发酵的正常周期，要尽可能地使微生物的比生长速率接近其最大值。n最大比生长速率不仅与微生物本身的性质有关，也与所消耗的底物以及培养的方式有关。n限制微生物生长代谢的并不是发酵液中营养物质的浓度，而是营养物质进入细胞的速度。 （三）稳定期稳定期n在细胞生长代谢过程中，培养基中的底物不断被消耗，一些对微生物生长代谢有害的物质在不断积累。受此影响，微生物的生长速率和比生长速率就会逐渐
9、下降，直至完全停止，这时就进入稳定期。n处于稳定期的生物量增加十分缓慢或基本不变；但微生物细胞的代谢还在旺盛地进行着，细胞的组成物质还在不断变化。 当微生物赖以生存的培养基中存在多种营养 物质时，微生物将优先利用其易于代谢的营养物质，至其耗用完时，降解利用其他营养物质的酶才能诱导合成或解除抑制。稳定期特点n此时，有的细胞开始老化、裂解，形成芽孢，并向培养基中释放出新的碳水化合物和蛋白质等，这些物质可以用来维持生存下来的细胞缓慢生长。n微生物的很多代谢产物，尤其是次级代谢产物，是在进入稳定期后才大量合成和分泌的。（四）死亡期死亡期n在死亡期，细胞的营养物质和能源储备已消耗殆尽，不能再维持细胞的生
10、长和代谢，因而细胞开始死亡。n这时，以生存细胞数目的对数对时间作图，可得一直线，这说明微生物细胞的死亡呈指数比率增加。n在发酵工业生产中，在进入死亡期之前应及时将发酵液放罐处理。第三节微生物生长动力学的基本概念一、微生物在一个密闭系统中的生长情况：时间菌体浓度延迟期指数生长期减速期静止期衰亡期延迟期：dxdt0 0指数生长期:mma ax x倍增时间倍增时间：td减速期:ddt 0 0静止期： ;dxdt0 0maxmaxXXXX衰亡期:dxdt0 0二、分批发酵产物形成的动力学二、分批发酵产物形成的动力学n (一)生产连动型产物形成(I型发酵)n微生物的生长、碳水化合物的降解代谢和产物的形成
11、几乎是平行进行的，营养期和分化期彼此不分开。n生产连动型产物通常都直接涉及微生物的产能降解代谢途径，或是正常的中间代谢产物。n酵母发酵生成酒精，以及葡萄糖酸和大部分氨基酸、单细胞蛋白都属于这种类型。二、Gaden对发酵的三分类与Pirt方程：一类发酵 产物的形成和菌体的生长相偶联xp分批生物工艺中各种比速率(生长速率、基质消耗qk和产物形成qp)之间关系的图示生产连动型n生产连动型产物的生成反应可表示如下：产物形成的比速率则与微生物的比生长速率呈正比。所以，对于这种类型的产物来说，调整发酵工艺参数，使微生物保持高的比生长速率，对于快速获得产物、缩短发酵周期十分有利。 n (二)部分生长连动型产
12、物形成(II型发酵)n部分生长连动型产物又称混合型产物，它们通常都间接地与微生物的初级产能代谢途径相关，是由产能代谢派生的代谢途径产生的。n其生成反应可表示为； 柠檬酸、衣糠酸、乳酸和部分氨基酸为这种类型产物的典型代表。 在分批发酵中，这种类型产物的形成分成两个极限：起初，微生物消耗大量底物用于产能代谢和生长，而产物形成很缓馒，甚至根本不形成； 此后，当微生物的生长速率开始减慢后，细胞开始大量消耗底物以合成产物。 对这类产物来说，营养期和分化期在时间上是彼此分开的。 二类发酵 产物的形成和菌体的生长部分偶联xpn分批生物工艺中各种比速率分批生物工艺中各种比速率(生长速率生长速率、基质消耗、基质
13、消耗qk和产物形成和产物形成qp)之间关系的图示之间关系的图示n(b)部分生长连动型部分生长连动型n产物的形成只与发酵液中的菌体浓度有关，而微生物的生长速率对它无直接影响。n对于这一类型发酵，只要能保证获得足够高浓度的生物量，就可以获得高速率的产物合成。 (三三)非生长连动型产物形成非生长连动型产物形成(型发酵型发酵)n非生长连动型的产物一般不是直接或间接来自微生物的产能降解代谢，而是通过两用代谢途径合成的。n在这一类型的发酵中，起初是微生物的初级代谢和菌体生长，而没有产物的合成。此时，营养物质的消耗非常大。 当培养基中的营养物质消耗尽、微生物的生长停止以后，产物才开始通过中间代谢大量合成。即
14、产生该类产物的微生物，其营养期和分化期在时间上是完全分开的。 非生产连动型的产物大多数是微生物的次级代谢产物，大多数的抗生素和生物毒素，以及维生素类。三类发酵 产物的形成和菌体的生长非偶联偶联xp分批生物工艺中各种比速率(生长速率、基质消耗qk和产物形成qp)之间关系的图示c)非生长连动型 Pirt方程 a+bqa=0、b0：可表示一类发酵qa0、b=0：可表示二类发酵qa0、b0：可表示三类发酵n例题1：以甘油为基质进行阴沟气杆菌分批培养，时间t=0时，X0=0.1g/L，S0=50g/L。反应方程式可以Monod方程表示，max=0.85h-1，Ks=1.23x10-2g/L，Yx/s=0
15、.53g/g（以细胞/葡萄糖计），若不考虑诱导期和死亡期，求培养至6h的菌体浓度。由菌体得率定义式，带入已知数值：53.0501.000/SXSSXXYsx00/SSXXYsx变形，得：S=-1.89X+50.2变形得：sxYXXSS/00XSKsSXdtdXrxmax因为：将公式（3）带入到（4）中，积分得：(1)(2)(3)(4)(5)000/000/max0lnln11SSXSYKYXXXSYKYttsxssxsxssx502 .5089. 1ln1 . 0501023. 11023. 153. 01 . 0ln11 . 0501023. 11023. 153. 085. 0162222
16、XXX=16g/Ln例题2：采用合成培养基，在1m3生物反应器中进行大肠杆菌分批培养，菌体的生长变化可利用Monod方程描述，已知max=0.935h-1，Ks=0.71kg/m3，基质初始浓度为50kg/m3，菌体初始浓度X0=0.1kg/m3，Yx/s=0.6kg/kg（以细胞/基质计），求当80%的基质已反应时所需时间。当80%的基质已反应时的基质浓度为S=50-(50 x80%)=10kg/m3由于在整体反应过程中SKs=0.71kg/m3Monod方程SKSsmaxXXdtdXrx935. 0max可以写成：S0=50kg/m3，S=40kg/m3，Yx/s=0.6(S0-S)Yx/s=40X0.6=24kgX=24.1时间从t=0至t=t时，菌体增量由0.1kg增至24kg,(1)式积分(1)(87. 51 . 01 .24ln935. 01935. 0241 . 0hXdXt第三节第三节 分批补料培养技术分批补料培养技术n 在传统的分批培养发酵工艺中，所有的物料都是在发酵开始前加入反应器中的。n一般来说，微生物生长所需要的营养物质浓度并不十分高，往往在10Ks以上时就可达
