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1、微生物检验方法微生物检验方法一、总则一、总则二、菌落总数二、菌落总数三、粪大肠菌群三、粪大肠菌群四、霉菌和酵母菌四、霉菌和酵母菌一、总则一、总则1.1.范围范围本规范规定了化妆品微生物学检验本规范规定了化妆品微生物学检验的基本要求。的基本要求。本规范适用于化妆品样品的采集、本规范适用于化妆品样品的采集、保存及供检样品制备。保存及供检样品制备。 2.2.仪器和设备仪器和设备天平天平 高压灭菌器高压灭菌器振荡器振荡器 三角瓶三角瓶(250mL)(250mL)玻璃珠玻璃珠 玻璃棒玻璃棒刻度吸管刻度吸管 (1 mL (1 mL、10mL)10mL)研钵或均质器恒研钵或均质器恒 温水浴箱温水浴箱v 生理
2、盐水生理盐水(成分：氯化钠成分：氯化钠 8.5g) 蒸馏水加至蒸馏水加至1000mL,溶解后，分装到加溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶玻璃珠的三角瓶内，每瓶90mL，103.43kPa（121 15 lb）20min高高压灭菌。压灭菌。v SCDLP 液体培养基液体培养基v 成分：酪蛋白胨成分：酪蛋白胨 17g 大豆蛋白胨大豆蛋白胨 3g 氯化钠氯化钠 5g 磷酸氢二钾磷酸氢二钾 2.5g 葡萄糖葡萄糖 2.5g 卵磷脂卵磷脂 1g 吐温吐温80 7g 蒸馏水蒸馏水 1000mLv 制法：先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其它成分混合，加制法：先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再
3、与其它成分混合，加热溶解，调热溶解，调pH为为7.27.3 分装，分装，103.43kPa（121 15 lb）20min 高高压灭菌。注意振荡，使沉淀于底层的吐温压灭菌。注意振荡，使沉淀于底层的吐温80 充分混合，冷却至充分混合，冷却至25左左右使用。右使用。v 注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。v 灭菌液体石蜡。灭菌液体石蜡。v 灭菌吐温灭菌吐温80。3.3.培养基和试剂培养基和试剂 所采集的样品，应具有代表性。所采集的样品，应具有代表性。 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。供检验样品，应严格保持原有的包装状态。 接到样品后，应
4、立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，的再污染和扩散， 所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应
5、条件下，按无菌操作规定进行。应条件下，按无菌操作规定进行。 如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自报告发出之日起该菌种及被检如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自报告发出之日起该菌种及被检样品应保存一个月。样品应保存一个月。4 4 样品的采集及注意事项样品的采集及注意事项 液体样品液体样品水溶性的液体样品水溶性的液体样品，可量取，可量取10mL 加到加到90mL 灭菌生理盐水中，如样品少于灭菌生理盐水中，如样品少于10mL，仍按，仍按10 倍稀释法进行。如为倍稀释法进行。如为5mL 则加到则加到45mL 灭菌生理盐水，混灭菌生理盐水，混匀后，制成匀后，制成1：10 检液。检液。油性液体样品，油性液体样品，
6、取样品取样品10mL，先加，先加5mL 灭菌液体石蜡混匀，再加灭菌液体石蜡混匀，再加10mL 灭灭菌的吐温菌的吐温80，在，在4044水浴中振荡混合水浴中振荡混合10min，加入灭菌的生理盐，加入灭菌的生理盐水水75mL（在（在4044水浴中预温），在水浴中预温），在4044水浴中乳化，制成水浴中乳化，制成1：10 的悬液。的悬液。5 5 供检样品的制备供检样品的制备 膏、霜、乳剂半固体状样品膏、霜、乳剂半固体状样品 亲水性的样品：亲水性的样品：称取称取10g，加到装有玻璃珠及，加到装有玻璃珠及90mL 灭菌生理盐水灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，静置的三角瓶中，充分振荡混匀，静置15m
7、in。用其上。用其上清液作为清液作为1:10 的检液。的检液。疏水性样品疏水性样品：称取称取10g，放到灭菌的研钵中，加，放到灭菌的研钵中，加10mL 灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加入灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加入10mL 灭菌吐温灭菌吐温80，研磨待溶解后，加，研磨待溶解后，加70mL 灭菌灭菌生理盐水，在生理盐水，在4044水浴中充分混合，制成水浴中充分混合，制成1：10 检液。检液。 固体样品固体样品称取称取10g10g，加到，加到90mL 90mL 灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为使其分散混悬，静置后，取上清液作为1
8、1：10 10 的检液。的检液。如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等，可称如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等，可称10g 10g 样样品加入品加入90mL90mL灭菌生理盐水，均质灭菌生理盐水，均质1min1min2min2min；疏水性；疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称膏、霜及眉笔、口红等，称10g 10g 样品，加样品，加10mL10mL灭菌液灭菌液体石蜡，体石蜡，10mL 10mL 吐温吐温8080，70mL 70mL 灭菌生理盐水，均质灭菌生理盐水，均质3min3min5min5min。二、菌落总数二、菌落总数1 1 范围范围本规范规定了化妆品中菌落总数的检验方法。本规范规定了化妆品中
9、菌落总数的检验方法。本规范适用于化妆品菌落总数的测定。本规范适用于化妆品菌落总数的测定。2 2 定义定义菌落总数（菌落总数（Aerobic bacterial count）是指）是指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度、培养时间、（如培养基成分、培养温度、培养时间、pH 值、需氧性质等），值、需氧性质等），1g（1mL）检样中所含）检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数。定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数。测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的
10、程测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度，是对样品进行卫生学总评价的综合依据。度，是对样品进行卫生学总评价的综合依据。3 3 仪器和设备仪器和设备 三角瓶，三角瓶，250mL。 量筒，量筒，200mL。 pH 计或精密计或精密pH 试纸。试纸。高压灭菌器。高压灭菌器。试管：试管：15150mm。灭菌平皿：直径灭菌平皿：直径9cm。灭菌刻度吸管，灭菌刻度吸管，10mL、1mL。酒精灯。酒精灯。恒温培养箱：恒温培养箱：361。放大镜。放大镜。生理盐水生理盐水 卵磷脂、吐温卵磷脂、吐温80营养琼脂培养基营养琼脂培养基 成分：蛋白胨成分：蛋白胨 20g、牛肉膏、牛肉膏 3g 、氯化钠、氯化钠 5g
11、、琼脂、琼脂 15g、卵磷脂卵磷脂1g、 吐温吐温80 7g、 蒸馏水蒸馏水 1000mL 制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温温80，将其他成分（除琼脂外）加到其余的蒸馏水中，将其他成分（除琼脂外）加到其余的蒸馏水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、溶解。加入已溶解的卵磷脂、 吐温吐温80，混匀，调，混匀，调pH 值为值为7.17.4，加入琼脂，加入琼脂，103.43kPa（121 15 lb）20min 高压灭菌，储存于冷暗处备用。高压灭菌，储存于冷暗处备用。 0.5氯化三苯四氮唑氯化三苯四氮唑成分：成分：TTC 0.5g 蒸馏水
12、蒸馏水 100mL溶解后过滤，溶解后过滤，103.43kPa（121 15 lb）20min 高压灭菌，装于棕色试剂瓶，置高压灭菌，装于棕色试剂瓶，置4冰箱备用。冰箱备用。4 4 培养基和试剂培养基和试剂(1) 用灭菌吸管吸取用灭菌吸管吸取1：10 稀释的稀释的检液检液2mL，分别注入到两个灭菌，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿平皿内，每皿1mL。另取。另取1mL 注注入到入到9mL 灭菌生理盐水试管中灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），更（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，制成换一支吸管，并充分混匀，制成1：100 检液。吸取检液。吸取2mL，分别注入，分别注入到两个灭
13、菌平皿内，每皿到两个灭菌平皿内，每皿1mL。如样品含菌量高，还可再稀释成如样品含菌量高，还可再稀释成1：1000 1:10000，等，每种稀等，每种稀释度应换释度应换1 支吸支吸管。(2) 将融化并冷至将融化并冷至4550的卵磷脂吐温的卵磷脂吐温80 营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置361培养箱内培养培养箱内培养48h2h。另取一。另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约个不加样品的灭菌空平皿，加入约15mL 卵卵磷
14、脂吐温磷脂吐温80 营养琼脂培养基，待琼脂凝营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置固后，翻转平皿，置361培养箱内培培养箱内培养养48h2h，为空白对照。，为空白对照。5 5 操作步骤操作步骤(3) 为便于区别化妆品中的为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每颗粒与菌落，可在每100mL 卵磷脂吐温卵磷脂吐温80 营养琼脂中营养琼脂中加入加入1mL0.5的的TTC 溶液，如有细溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。而化妆品的颗粒颜色无变化。6 6 菌落计数方法菌落计数方法 先用肉眼观察，点数菌落数，然后再先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放
15、大用放大 5 倍倍10 倍的放大镜检查，倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。以代表全皿菌落数。 (1)首先选取平均菌落数在首先选取平均菌落数在30 个
16、个300 个之间的平皿，作为个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数（见表乘其稀释倍数（见表1 中例中例1）。）。 (4)若所有稀释度的平均菌落数均小于若所有稀释度的平均菌落数均小于30 个，则应按稀释度最低的平均菌落个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表数乘以稀释倍数报告之（见表1 例例5）。）。7 菌落计数及报告方法菌落计数及报告方法 (5)若所有稀释度的平均菌落数均若所有稀释度的平均菌落数均不在不在30 个个300 个之间，其中一个之间，其中一个稀释度大于个稀释度大于300 个，而相邻的个，而相邻的另一稀释度小于另一稀释度小于30 个时，则以接个时，则以接近近30 或或300 的平均菌落数乘以稀的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表释倍数报告之（见表1 中例中例6）。）。(3)若所有稀释度的平若所有稀释度的平均菌落数均大于均菌落数均大于300 个，则应按稀释度最个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以高的平均菌落数乘以稀释稀
