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1、 微生物的培养和应用微生物的培养和应用课题课题1 1 微生物的实验室培养微生物的实验室培养一、培养基1、概念： 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养基质。 一般都含有 四类物质。2、营养成分：碳源、氮源、水、无机盐 营养物质含义主要来源碳源提供碳元素的物质无机物：CO2、NaHCO3；有机物：糖类、脂肪酸、石油等氮源提供氮元素的物质无机物：N2、NH3、氨盐、硝酸盐；有机物：尿素、牛肉膏、蛋白胨水细胞生命活动必不可少的物质无机盐提供除碳、氮元素以外的各种重要元素培养基还需要满足不同微生物生长对pH、氧气、特殊营养物质的要求培养基的配制原则(1)目的要明确(2)营养要协调
2、(3)pH要适宜按形态划分固体培养基液体培养基半固体培养基微生物在 培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落固体 根霉根霉 曲霉曲霉 青霉青霉4、分类：固体培养基半固体培养基液体培养基主要用于微生物的分离、计数等主要用于观察微生物的运动、鉴定菌种等主要用于工业生产需加入凝固剂，如琼脂按用途划分按用途划分基础培养基：鉴别培养基:含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。在培养基中加入特殊营养物质或化学物质，有利于特定微生物的生长，同时抑制其它微生物的生长。选择培养基:用于鉴别不同类型微生物的培养基。微生物产生某
3、种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化。按成分划分：天然培养基和合成培养基选择培养基（白P6）加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HAT）的培养基:分离杂交瘤细胞二、无菌技术（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行 。（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行 。（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在（4）
4、实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 清洁和消毒灭菌获得纯净微生物的关键是防止外来杂菌的入侵酒精灯火焰附近进行消毒灭菌概念指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的 微生物(不包括 )指使用强烈的理化因素杀死物体内外 微生物，包括 。常用方法适用对象操作空间、液体、双手等接种环、接种针、玻璃器皿，培养基等部分部分芽孢和孢子芽孢和孢子所有所有芽孢和孢子芽孢和孢子煮沸消毒法、 巴氏消毒法、 化学药剂消毒法、 紫外线消毒法灼烧灭菌、 干热灭菌、 高压蒸汽灭菌课P851.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是
5、否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1） 培养细菌用的培养基与培养皿（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管（3） 实验操作者的双手避免操作者被微生物感染（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒。）需要消毒。计算称量溶化灭菌倒平板三、微生物培养的实验操作1、制备培养基制备培养基纯化大肠杆菌（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养大肠杆菌）牛肉膏蛋白胨固体培养基配方牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL1.计算操作步骤 根据牛肉膏、蛋白胨固体培养基配方的比例，计算配置100mL培养基是各成分的用量2
6、.称量准确称取各种成分 注意：1、牛肉膏比较粘稠，可用玻璃棒挑取，放在称量纸上称量2、牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称取动作要快，称后要及时盖上瓶盖3.溶化（1）将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯，加入少量水，加热。（2）当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸(3)加入称量好的蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌，使其溶解(4)加入琼脂，加热使其熔化。并不断用玻璃棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。(5)当琼脂完全融化后，补加蒸馏水至100mL。4.灭菌5.倒平板 将50ml培养基用玻璃棒转移至锥形瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为1
7、21，灭菌1530min。 将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160170 下灭菌2h。待培养基冷却到50 左右时（课P14），在酒精灯火焰附近倒平板（先调pH，后灭菌）倒平板倒平板:20 在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞； 右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰； 左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。 待平板冷却凝固后，将平板倒置。1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？可用手触摸锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手时，就可以倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污
8、染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？ 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既避免培养基表面的水分过快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。2、纯化大肠杆菌平板划线法:稀释涂布平板法:接种方法.连续划线，连续划线，.逐步稀释逐步稀释.梯度稀释，梯度稀释，.分别涂布分别涂布. 原理 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释
9、分散到培养基表面。在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落。 将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环_在_旁冷却接种环，并打开棉塞 将试管口通过火焰 将已_的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液 火焰冷却烧红 将试管通过火焰，并塞上棉塞 左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划_条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。三至五三至五灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的_开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。末端末端将平板_放入培养箱中培养。倒置灼烧接种环冷却 划线 （第一区域）蘸取菌液
10、灼烧接种环冷却 划线 （第二区域）灼烧接种环冷却 划线 （第三区域）灼烧接种环冷却 划线 （第四区域）灼烧接种环冷却 划线 （第五区域）灼烧接种环平板倒置放置培养问题2：每次划线前灼烧接种环的目的：问题3：划线结束后灼烧接种环的目的：避免接种环上可能存在的微生物污染培养基杀死上次划线结束后残留的菌种，使每次划线的菌种来自上次划线末端及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。问题1：第一步灼烧接种环的目的：2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目
11、比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。稀释涂布平板法 原理： 将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的菌落。 1.将分别盛有9mL水的6支试管灭菌，并按101106的顺序编号。系列稀释操作2.用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。系列稀释操作3.从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第2步的操作。依次类推，直到完成最后一支试管的
12、稀释。注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管离火焰12cm处将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 取少量稀释液滴加到培养基表面 待酒精燃尽后冷却810s 将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃灼烧用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀稀释涂布平板法涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。注意：1.将涂布器末端浸在70%的酒精中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。2.操作中一
13、定要防火！不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中(3)菌种培养： 将接种的培养基和一个未接种的培养基倒置放入37的恒温箱中。( (4)实验结果观察:未接种的培养基表面是否有菌落生长？菌落的形态、大小、颜色？(5)菌株的保存方法4冰箱保藏甘油管藏（-20）临时保存：长期保存：固体斜面纯化大肠杆菌的实验是否需要设置对照实验？(3)菌种培养： 将接种的培养基（至少3个）和一个未接种的培养基倒置放入37的恒温箱中。( (4)实验结果观察:未接种的培养基表面是否有菌落生长？菌落的形态、大小、颜色？(5)菌株的保存方法4冰箱保藏甘油管藏（-20）临时保存：长期保存：固体斜面纯化大肠杆菌的实验是否需要设置对照实验？煮沸消毒法：巴氏消毒法：化学药剂：紫外线：针对不耐高温的液体接种室、超净工作台培养皿.吸管等玻璃器皿耐高温、需保持干燥灼烧灭菌：干热灭菌：高压蒸汽灭菌：接种环等金属工具实验操作者的双手培养基1、消毒方法2、灭菌方法纯化大肠杆菌接种大肠杆菌于培养基上，经过培养使其形成由单个细胞繁殖形成的子细胞群体，即菌落。
