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1、实验一实验一 微藻的培养基配制微藻的培养基配制 一、实验目：一、实验目：掌握微藻的培养基配制方法。掌握微藻的培养基配制方法。以海水单胞藻培养液通用配方以海水单胞藻培养液通用配方“f/2”为例为例二、实验原理二、实验原理 藻类的培养液必须具备藻类的生长繁殖所需要的各种营养元藻类的培养液必须具备藻类的生长繁殖所需要的各种营养元素，并且营养盐的比例应该符合藻类生长繁殖的需要。不同种素，并且营养盐的比例应该符合藻类生长繁殖的需要。不同种类的微藻对营养盐的质和量的需求不同，各有其特殊性，因此，类的微藻对营养盐的质和量的需求不同，各有其特殊性，因此，制定某种微藻的一个培养液配方时，首先必须进行一系列的试制
2、定某种微藻的一个培养液配方时，首先必须进行一系列的试验，了解这该种藻类对营养的要求，并在使用中验证配方的效验，了解这该种藻类对营养的要求，并在使用中验证配方的效果，加以改进，使配方达到更理想的水平。藻类对营养盐的需果，加以改进，使配方达到更理想的水平。藻类对营养盐的需求也有很多共同点，因而一些培养液配方（求也有很多共同点，因而一些培养液配方（如如F/2）可应用于多）可应用于多种藻类的培养。种藻类的培养。 进行微藻培养时，可根据培养藻类对营养的要求，选用合适进行微藻培养时，可根据培养藻类对营养的要求，选用合适的配方，在的配方，在消毒水消毒水中按配方加入中按配方加入各种营养物质各种营养物质配成。所
3、加肥料配成。所加肥料应保持清洁，某些不清洁肥料必须消毒，预防敌害生物通过肥应保持清洁，某些不清洁肥料必须消毒，预防敌害生物通过肥料污染。料污染。 绿藻培养液配方：绿藻培养液配方：海洋三号扁藻培养液（海洋研究所，海洋三号扁藻培养液（海洋研究所，1960）：）： NaNO3 0.1g 2Na3C6H5O7 11H2O 0.02gK2HPO4 0.01gFe(SO4)3(1%溶液溶液) 10滴滴 海水海水 1000ml亚心形扁藻培养液（湛江水产学院）：亚心形扁藻培养液（湛江水产学院）：NaNO3 0.05g 维生素维生素B12 200mgKH2PO4(1%溶液溶液) 0.005g 人尿人尿 2mlF
4、eC6H5O7 0.2ml 维生素维生素B1 200g 海水海水 1000ml培养亚心形扁藻及其他绿藻使用，多用于小型培养和中继培养，如能培养亚心形扁藻及其他绿藻使用，多用于小型培养和中继培养，如能加入海泥抽出液加入海泥抽出液20ml，效果更好。，效果更好。硅藻培养液配方：硅藻培养液配方：艾伦艾伦-内尔森（内尔森（Allen-Nelson）培养液）培养液Allen，E.J.et al （1910）：A. KNO3 20.2g 纯水纯水 100mlB. Na2HPO4.12H2O 4.0g CaCl.6H2O 4.0gHCl（浓）（浓） 2.0ml 纯水纯水 80mlFeCl3（溶液）（溶液）
5、2.0mlB液的配制法：先把氧化钙液的配制法：先把氧化钙4g溶解于溶解于40ml纯水中。另外把磷酸氢二钙纯水中。另外把磷酸氢二钙4g溶溶解于解于40ml纯水中，再把三氯化铁溶融液纯水中，再把三氯化铁溶融液2ml，缓慢滴入，摇动，产生白色，缓慢滴入，摇动，产生白色沉淀，加热，缓慢滴入浓盐酸沉淀，加热，缓慢滴入浓盐酸2ml，沉淀的白色沉淀即重新溶解。把以上两，沉淀的白色沉淀即重新溶解。把以上两溶液混合。溶液混合。使用时，取使用时，取A液液2ml和和B液液1ml，加入，加入1000ml海水中，充分混合后加热消毒，海水中，充分混合后加热消毒，消毒后静置消毒后静置24h，然后将上层清夜倒出使用。，然后将
6、上层清夜倒出使用。 培养液是根据培养液配方配制的。为了减少每次称量的麻培养液是根据培养液配方配制的。为了减少每次称量的麻烦，固体的营养元素一般都配成母液烦，固体的营养元素一般都配成母液（如浓缩（如浓缩1000倍的母倍的母液）液），在使用时，只要吸取一定的量加入培养液中即成。主，在使用时，只要吸取一定的量加入培养液中即成。主要营养元素可以单项营养元素配成母液，也可以分成若干组，要营养元素可以单项营养元素配成母液，也可以分成若干组，每组每组2种或多种营养元素同配在一起。微量元素和辅助生长有种或多种营养元素同配在一起。微量元素和辅助生长有机物质也多种组合在一起，配成母液。在浓营养溶液中一般机物质也多
7、种组合在一起，配成母液。在浓营养溶液中一般生物因不能忍受而死亡。生物因不能忍受而死亡。 三、实验材料及用具三、实验材料及用具1、器材、器材电炉；灭菌锅；电炉；灭菌锅；pH计计 500ml 试剂瓶（每组试剂瓶（每组5个）；个）； 玻棒、玻棒、500ml烧杯、烧杯、50ml容量瓶（每组一个）容量瓶（每组一个）/牛皮纸、细绵绳牛皮纸、细绵绳 2、试剂：、试剂：蒸馏水、海水蒸馏水、海水各种试剂各种试剂NaNO3; NaH2PO4；FeCl3 EDTA；Na2SiO3.9H2O；盐酸硫铵素；盐酸硫铵素(VB1) ；Biotin VH三、实验步骤三、实验步骤（一）（一） F/2 (+ Si)培养基母液的配
8、制（用去离子水配制）培养基母液的配制（用去离子水配制）1.A液液 500 ml 1000倍倍NaNO3 37.5 g; NaH2PO4 2.5 g2.B液液 500 ml 1000倍倍Fe-EDTA 2.5 g (FeCl3 1.6 g + EDTA 0.9 g)3.C液液 500 ml 1000倍倍 Na2SiO3.9H2O 10 g4.D液液 500 ml 1000倍倍 盐酸硫铵素盐酸硫铵素(VB1) 5 mg (试剂试剂 50 mg/ml取取100 l) Biotin VH 0.025 mg (试剂试剂 0.1 mg/ml取取250 l) VB12 0.025 mg (试剂试剂 0.25
9、 mg/ml取取100 l)先用维生素分别用纯水溶解混合，稀先用维生素分别用纯水溶解混合，稀HCl将将pH调到调到4.55.0，最后用纯水，最后用纯水稀释至稀释至1升。膜过滤后冰冻保存。升。膜过滤后冰冻保存。5.E液液 500 ml 1000倍倍 CuSO4.5H2O 0.0098 mg； ZnSO4.7H2O 0.022 mg CaCl2.6H2O 0.01 mg； MgCl2.4H2O 0.180 mg Na2MoO4.2H2O 0.0063 mgA、B、D、E高压灭菌备用高压灭菌备用（三）（三）F/2培养基配制培养基配制1000 ml (1升升) F/2 (+ Si)培养基培养基 = 1
10、000 ml (1升升)过滤灭菌海水过滤灭菌海水 + 1ml A液液 + 1ml B液液+ 1ml D液液+ 1ml E液液 (+ 1ml C液液)注意：煮沸的海水放置凉后（注意：煮沸的海水放置凉后（50度以下）再加母液，否则会出现沉淀。度以下）再加母液，否则会出现沉淀。（二）海水处理（二）海水处理沉淀沉淀 砂池过滤砂池过滤 （抽滤）（抽滤）灭菌（海水放于三角瓶灭菌（海水放于三角瓶中，置于电炉上煮沸，可杀来一般细菌）中，置于电炉上煮沸，可杀来一般细菌）实验二实验二 单细胞藻类的培养单细胞藻类的培养 一、实验目的一、实验目的掌握单细胞微藻的实验室培养掌握单细胞微藻的实验室培养(藻种培养藻种培养)
11、方法，细胞生长曲线观察。方法，细胞生长曲线观察。二、实验材料及用具二、实验材料及用具1、实验材料：小球藻（、实验材料：小球藻（500ml）、等鞭金藻、扁藻）、等鞭金藻、扁藻2、实验仪器：可见分光光度计、显微镜（、实验仪器：可见分光光度计、显微镜（1部部/组）、血球计数板（一个组）、血球计数板（一个/组）、电炉、灭菌锅、组）、电炉、灭菌锅、pH计、计、 500ml烧杯（烧杯（1个个/组）、胶头滴管（组）、胶头滴管（3支支/组）、组）、 250ml锥形瓶（每组锥形瓶（每组3个）、牛皮纸、细绵绳个）、牛皮纸、细绵绳3、试剂：蒸馏水、海水、碘化钾、试剂：蒸馏水、海水、碘化钾三、实验步骤三、实验步骤1、
12、培养基配制：见实验一、培养基配制：见实验一2、接种：一般培养的接种量为、接种：一般培养的接种量为1/31/5.3、计数：分光光度计测定、计数：分光光度计测定500nm（OD500）和）和750nm（OD750）吸光值；细胞计数板计数。）吸光值；细胞计数板计数。4、每天测定一次，分别绘制以、每天测定一次，分别绘制以OD值和细胞绝对数目为纵坐值和细胞绝对数目为纵坐标、时间为横坐标的生长曲线，分析细胞数目与标、时间为横坐标的生长曲线，分析细胞数目与OD500和和OD750的相关性。的相关性。5、观察并描述微藻不同生长时期的特点、观察并描述微藻不同生长时期的特点小球藻小球藻扁藻扁藻球等鞭金藻球等鞭金藻
13、1、血球计数板计数方法：、血球计数板计数方法：（1） 搅拌：由于藻类细胞在培养液中分布不均匀，所以在取产前必须进行搅搅拌：由于藻类细胞在培养液中分布不均匀，所以在取产前必须进行搅拌，搅拌后立即取样。拌，搅拌后立即取样。（2）固定、稀释：运动细胞需加碘液杀死才能计数。如细胞浓度过大，计数）固定、稀释：运动细胞需加碘液杀死才能计数。如细胞浓度过大，计数困难，需把水样稀释到适宜的程度。（困难，需把水样稀释到适宜的程度。（附：鲁哥氏液（附：鲁哥氏液（Lugols Solution）又称）又称碘液，常用的配方是：将碘液，常用的配方是：将6克的碘化钾溶于克的碘化钾溶于20毫升水中，待完全溶解后加入毫升水中
14、，待完全溶解后加入4克碘，摇克碘，摇荡，待碘完全溶解后，加入荡，待碘完全溶解后，加入80毫升蒸馏水，贮存在棕色试剂瓶内。）毫升蒸馏水，贮存在棕色试剂瓶内。）（3） 计数板与盖玻片洗净擦干计数板与盖玻片洗净擦干盖好盖玻片盖好盖玻片摇荡藻液摇荡藻液吸取藻液吸取藻液（干的微吸管）（干的微吸管）迅速加样迅速加样1分钟后低倍镜下计数计数任何对角两大分钟后低倍镜下计数计数任何对角两大格（加盖玻片后每一大格即形成一个体积为格（加盖玻片后每一大格即形成一个体积为0.1立方毫米的空间），然后取其立方毫米的空间），然后取其平均值。每个样品须重复计数两次。平均值。每个样品须重复计数两次。1毫升水体藻细胞计算平均值毫
15、升水体藻细胞计算平均值10,000藻稀释倍数藻稀释倍数 2、分光光度计定量法、分光光度计定量法 比色皿用比色皿用75酒精消毒后，将藻液摇匀，倒入酒精消毒后，将藻液摇匀，倒入2/3体积，在两个波长体积，在两个波长下测定吸光度值。注意分光光度计测定前要调零和调满度。下测定吸光度值。注意分光光度计测定前要调零和调满度。 作业作业:1、分别绘制以、分别绘制以OD值和细胞绝对数目为纵坐标、时间为横坐标的生值和细胞绝对数目为纵坐标、时间为横坐标的生长曲线长曲线(三张图三张图)，分析细胞数目与，分析细胞数目与OD500和和OD750的相关性（两次的相关性（两次相关性），比较哪个波长下的密度值更能代表藻细胞数
16、目。相关性），比较哪个波长下的密度值更能代表藻细胞数目。5、观察并描述微藻不同生长时期的特点。、观察并描述微藻不同生长时期的特点。实验三实验三 藻类细胞叶绿素的提取和细胞色素的观察藻类细胞叶绿素的提取和细胞色素的观察一、实验目的一、实验目的 掌握大型和微型海藻叶绿素测定方法。观察比较不同门藻类的叶绿掌握大型和微型海藻叶绿素测定方法。观察比较不同门藻类的叶绿素的吸收光谱。素的吸收光谱。 叶绿素含量是衡量大型海藻生长状态的指标之一。浮游植物叶绿素叶绿素含量是衡量大型海藻生长状态的指标之一。浮游植物叶绿素含量，可用来初步估量浮游植物的光合作用能力，并进行估量水域初级含量，可用来初步估量浮游植物的光合作用能力，并进行估量水域初级生产力。也适用于评价实验室单种生长状况。生产力。也适用于评价实验室单种生长状况。 二、实验材料及用具二、实验材料及用具1 1、实验材料：海带、实验材料：海带、 裙带菜、紫菜、小球藻、球等鞭金藻等裙带菜、紫菜、小球藻、球等鞭金藻等, ,选选4 4种藻种藻2 2、实验仪器：紫外分光光度计、实验仪器：紫外分光光度计(208(208实验室实验室) )3 3、实验器材：研钵（每组
