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1、免疫室乙肝两对半操作规程一、试验原理“乙肝两对半”指乙型肝炎病毒表面抗原（HBSAg）,乙型肝炎病 毒表面抗体（HBSAb）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）、乙型肝炎病毒 e抗体（HBeAb）乙型肝炎病毒核心抗体（HBCAb）此五项指标，目 前国内医院最常用的乙肝病毒感染检测血清标志物，判断是否感染乙 肝与粗估病毒复制水平初步检查。两对半中各项试验反应原理如下：1、 乙型肝炎病毒表面抗原检测：采用ELISA “双抗体夹心法”原理，用抗TBs包被板条，用HRP 标记抗TBs为 酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB）和过氧化物为底 物。当标本中存在HBSAg时，该表面抗原与包被抗-HBS结合并与抗
2、-HBs-HRP结合形成抗-HBs-HBSAg-抗-HBsTRP复合物，加入TMB底物 产生显色反应，反之则无显色反应。在试验结束时，有颜色变化的， 提示有HBSAg存在,无颜色或颜色变化微弱的，则提示不存在HBSAgo2、 乙型肝炎病毒表面抗体检测：采用ELISA “双抗原夹心法”检测人血清或血浆中的抗-HBS,采 用HBSAg包被反应板,加入待测标本，同时加入HBSAg-HRP进行孵育。 当标本中存在抗-HBS时，该抗体与包被的HBSAg结合并与酶结合物 形成HBSAg-抗TBSTBSAgTRP复合物，洗去游离反应物，加入显色 剂，将有明显颜色变化；当标本中没有抗-HBS时，加入底物后没有
3、 或只有很轻微的颜色变化。3、乙型肝炎病毒e抗原检测:采用ELISA “双抗体夹心法”检测，用单抗TBe包被板条，用 HRP标记抗TBe为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB）和过氧化物为 底物。当标本中存在HBeAg时，该HBeAg与包被抗TBe结合并与抗 -HBe-HRP结合形成抗TBeTBeAg-抗TBeTRP复合物，加入TMB底物 产生显色反应，反之则无显色反应。在试验结束时，有颜色变化的， 提示有HBeAg存在,无颜色或颜色变化微弱的，则提示不存在HBeAgo4、 乙型肝炎病毒e抗体检测：采用LEISA ”中和竞争法”检测抗-HBe,用单抗TBe包被板条, 用HRP标记的多抗-HBe为酶
4、标记物，以四甲基联苯氨（TMB）和过氧 化物为底物。加入待测的标本，同时加入基因工程HBeAg和多抗 -HBe-HRP,当标本中抗TBe含量高时，则抗TBeTRP与HBeAg结合后 形成游离物被洗涤掉，加入TMB底物时显色淡，反之则显色深。在试 验结束时，无颜色或颜色变化微弱的，提示有抗TBe存在，显色深 时，则提示不存在抗-HBe。5、 乙型肝炎病毒核心抗体检测：采用ELISA 竞争抑制法”检测抗-HBc,用基因工程重组HBcAg 包被板条，用HRP标记的抗TBc为酶标记物，以四甲基联苯氨（TMB） 和过氧化物为底物。加入待测标本，同时加入抗TBc-HRP,与抗原形 成竞争结合，当标本中抗-
5、HBc含量高时，则抗-HBc-HRP与HBCAg结 合少，加入TMB底物时显色淡，反之显色深。在试验结束时，无颜色 或颜色变化微弱的，提示有抗-HBC存在，显色深时，则提示不存在 抗-HBc。二、样本要求1、无需空腹，可血清或血浆标本；新鲜标本无菌冷藏1周可用； 可冷冻保存，但避免反复冻融。样品中含叠氮钠会影响结果；高 度溶血或没完全收缩的血清样品或有微生物污染的样品可能会 引起错误的结果。2、试剂：我室“乙肝两对半”检测试剂盒由上海荣盛生物药业有 限公司提供3、设备：洗板机1台、酶标仪1台、微量振荡器1台、打印机1 台、加样器1把、吸嘴(50-250ul)三、操作步骤1、试剂盒准备试剂贮存在
6、2-8C冰箱，实验前应提前30min取出，使其恢复至 室温，待用。2、加样(1)准备实验所需反应孔在以上实验原理中可以看出“乙肝五项”中每个项目必须对应各自反应孔，不可错位摆放，否 则直接导致错误报告发出。(2)乙肝表面抗原：第一步，先加样本IooII1,温育30-4OnIin； 第二步，加酶结合物50Ul (1滴)，温育30min,洗板10次，加 显色剂A/B各1滴显色看结果。具体步骤：采用“两步法”，结果需用酶标仪比色，读取OD值。每次试验，每块表面抗原测试板均需要设空白孔1孔、阴性对照孔2孔、阳性对照孔1孔、质控（最低值）孔1孔。A：样品（阴性、阳性、质控）各IOOU1,加入各自对应的反
7、应 孔中，封板、温育30-40IninB:加酶结合物1滴（瓶身垂直滴加，挤掉前面有气泡成分），振 荡混匀30”,温育30IninC：洗板10次（最好中间有一次手动拍板），自来水冲洗3-5遍， 拍干D：加显色剂A、B液各1滴，避光显色15min,加终止液1滴， 酶标仪上比色E：结果判读临界值（Cutoff）二阴性对照平均OD值义2.1（阴性对照OD值0. 05,按0. 05计算;大于0. 05按实际值算） 样本OD值Cutoff值为阳性，Cutoff值为阴性对于SAg为阳性标本，为验证结果可靠、正确性，各实验室要求， 有些将阳性标本留下重复检测，若为阳性才发出报告。我科室为 提高报告时效性，让病
8、人尽快取得结果，将SAg阳性标本随即用 胶体金方法即乙肝表面抗原试纸条代替，再次验证结果准确性, 若为阳性（与酶免结果一致）发阳性；若为阴性（与酶免结果不 符）需用酶免方法重复检测，方可发出报告。（3）表面抗体（4） e抗原（5） e抗体（6） c抗体此四项具体操作步骤大致相同，均为“一步法”，因未上酶标仪比色，无需做阴阳性对照，如下：D1：取所需反应孔，加样50ulD2：加各自对应酶结合物1滴（50ul）,注意：“乙肝e抗体”检测（以上海荣盛试剂为例），在加完样本后，先加“中和试剂”1滴，再加“酶结合物” 1滴，不可漏加D3：振荡充分混匀，各温育30IninD4：洗板5次，流水冲洗1-2遍，
9、拍干板孔D5：加显色剂A、B各1滴（50ul）,避光显色15minD6：结果判读（肉眼）SAg. eAg：显色（蓝色）为阳性，不显色为阴性eAb. cAb：显色（蓝色）为阴性，不显色为阳性严格意义来说，严格按照试剂盒说明书来操作更好。须注意“乙肝核心抗体”标本要 作1： 30稀释，血清中若检测到低滴度的抗HBC,往往只表明既往感染，有流行病学意义, 只有检测到高滴度抗体（1： 30）或连续检测抗体滴度升高，才作为感染指标。3、报告模式1、1.3.52、1.4.53、1.54、2.55、2.4.56、2.47、28、59、4.510、全阴四、注意事项1、标本尽量新鲜，血清待完全析出，避免溶血或有
10、污染的标本2、确保加样量要准确，使用微量移液器手工加样时，每次应该更换吸嘴吸取样本3、用滴瓶滴加时，请先摇匀，并弃去1-2滴后垂直匀速滴加，避 免将其内的液体触到或溅到微孔边缘，特别是酶结合物4、尽量避免微孔中产生气泡5、封板胶纸不能重复使用6、水浴温度严格控制在377、洗板时所用吸水纸请勿反复使用8、请勿使用带有纸屑的吸水材料拍板，以防外源性过氧化物酶类 似物或氧化还原物质与显色剂发生反应，影响反应结果准确性9、洗板机最好在每次使用前、后用蒸储水或去离子水冲洗干净, 以防管路堵塞或腐蚀10、浓缩洗涤液为高浓度的磷酸盐，可能会形成结晶，请37充 分溶解稀释后用Ik洗板机洗液量既要避免过量溢出又能充满反应微孔为宜
