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1、课题课题3 血红蛋白血红蛋白的提取和分离的提取和分离一、课题的目标：通过尝试对血液中血红蛋白的一、课题的目标：通过尝试对血液中血红蛋白的 提取和分离，提取和分离，理解色谱法、电泳法理解色谱法、电泳法二、二、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法课题重点：凝胶色谱法的原理和方法三、课题难点：样品的预处理、色谱柱填料的处理三、课题难点：样品的预处理、色谱柱填料的处理 和色谱柱的装填和色谱柱的装填思考：思考：“课题课题1-DNA1-DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定” ” 实验理想的材实验理想的材料是什么？料是什么？ “ “课题课题3-3-血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离”这实验理想的材料又是什么
2、？原因是？这实验理想的材料又是什么？原因是？ 答：鸡的红细胞具有细胞核，答：鸡的红细胞具有细胞核，含有含有DNADNA，便便于进行于进行DNADNA的提取，哺乳类动物成熟的红细胞的提取，哺乳类动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单无细胞核，结构简单，血红蛋白，血红蛋白含量丰富含量丰富便便于提取血红蛋白。于提取血红蛋白。一、基础知识一、基础知识：（一）（一）蛋白质分离原理蛋白质分离原理 （二）二）蛋白质分离蛋白质分离的方法的方法 1）凝胶色谱法：又称分配色谱法）凝胶色谱法：又称分配色谱法 2）电泳法）电泳法（三）缓冲液的作用三）缓冲液的作用二、实验操作实验步骤二、实验操作实验步骤 血液组成成分血液组
3、成成分 （1）洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞 （2）释放释放血红蛋白血红蛋白 （3）分离分离血红蛋白血红蛋白 （4）透析透析血红蛋白血红蛋白1、样品、样品 处理处理3、纯化、纯化4、纯度鉴定、纯度鉴定2、粗分离、粗分离SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度鉴定血红蛋白纯度凝胶色谱法进行纯化凝胶色谱法进行纯化注意事项注意事项蛋白质提取与分离的依据蛋白质提取与分离的依据 蛋白质的物理化学性质差异：蛋白质的物理化学性质差异： 1.1.分子的形状、大小分子的形状、大小 2.2.电荷性质和多少电荷性质和多少 3.3.溶解度溶解度 4.4.吸附性质吸附性质 5.5.对其他分子亲和力对其他
4、分子亲和力 1.1.凝胶色谱法凝胶色谱法 一些微小一些微小多孔的球体多孔的球体（内含许多贯穿的（内含许多贯穿的通道通道，具多孔的凝胶就叫，具多孔的凝胶就叫分子分子筛筛）根据根据相对分子质量的大小相对分子质量的大小分离蛋白质的方法分离蛋白质的方法（2）概念：）概念：（1）凝胶）凝胶3 3、原理、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，当不同的蛋白质通过凝胶时，（ ）的蛋白质容易进入凝）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（胶内部的通道，路程（ ），移动速度），移动速度（ ），而（），而（ ）的）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（）移动，路程（ ）
5、，移），移动速度（动速度（ ），相对分子质量不同的），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快总结：大分子经过路程短，流动快；总结：大分子经过路程短，流动快； 小分子经过路程长，流动慢。小分子经过路程长，流动慢。洗脱：洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 4、具体过程、
6、具体过程2凝胶电泳法：凝胶电泳法：1）原理：）原理：不同蛋白质的不同蛋白质的带电性质带电性质（正电荷或负电荷）（正电荷或负电荷）、电量、电量、分子形状和大小分子形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。向和运动速度不同。2）影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素电泳：电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程3）常用电泳方法）常用电泳方法 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙酰胺凝胶电泳聚丙酰胺凝胶电泳
7、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 在测定蛋白质分子量时通常用SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳，使用时可选用一组已知分子量的标准蛋白同使用时可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳做对照，根据两者的电泳区带位置，利时进行电泳做对照，根据两者的电泳区带位置，利用相关计算公式算出相对分子量用相关计算公式算出相对分子量 SDS SDS 带负电荷多的带负电荷多的 ，因而掩盖了不同种蛋白质，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷的差别，间的电荷的差别，使蛋白质使蛋白质迁移速率仅取决于分子迁移速率仅取决于分子大小大小。 影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素 决
8、定决定运动方向运动方向决定决定运动速率运动速率电荷性质电荷性质电荷量电荷量分子形状分子形状分子大小分子大小由由弱酸弱酸和相应的和相应的强碱盐强碱盐溶解于溶解于水水中。中。如如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等等缓冲溶液洗脱剂缓冲溶液洗脱剂 （1）作用：）作用： （2）配制：）配制：抵制外界酸碱对溶液抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而的干扰而保持保持 pH稳定。稳定。 （3 3）在血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲液的原因？）在血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲液的原因？ 目的是利用缓冲液目的是利用缓冲液模拟细胞内的模拟细胞内的PH环境环境，保证血红蛋白的保证血红蛋白的正常结
9、构正常结构和和功能功能。血液组成成分血液组成成分阅读思考：阅读思考：1. 血液由血液由_和和_两部分组成。两部分组成。2. 血细胞中血细胞中_细胞数量最多，细胞的含量细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是最高的化合物是_。3. 该化合物是由该化合物是由 _和和_构构成的，其中每个亚基中都含有一个能与成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和和CO2结合的结合的_基团。基团。血浆血浆血细胞血细胞红细胞红细胞血红蛋白血红蛋白2条条-肽链肽链2条条-肽链肽链 亚铁血红素亚铁血红素1.洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞阅读思考：洗涤的阅读思考：洗涤的目的目的是什么？是什么？ 洗涤的洗涤的方法方法是什么？是什么
10、？ 洗涤干净洗涤干净的标志是什么？的标志是什么？血液血液100mL3g柠檬酸钠柠檬酸钠低速短时低速短时间离心间离心红细胞红细胞血浆血浆吸出血浆吸出血浆红细胞红细胞5倍体积生理盐水倍体积生理盐水搅拌搅拌10min重复洗涤重复洗涤3次，次，直至上清液没有黄色直至上清液没有黄色2.释放血红蛋白释放血红蛋白阅读思考：阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质，有什么用？哪些物质，有什么用？目的分析：目的分析：1. 蒸馏水蒸馏水的作用是的作用是_。2. 加入加入甲苯甲苯的作用是的作用是_。3. 充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸
11、水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂滤纸滤纸过滤过滤脂类物质脂类物质3.3.分离血红蛋白分离血红蛋白分离过程分离过程红细胞红细胞混合液混合液高速离心高速离心10min 离心离心管管烧杯烧杯有机溶剂有机溶剂血红蛋白血红蛋白20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液4.透析血红蛋白透析血红蛋白透析的目的是什么？透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血红蛋白中的小分子杂质去除血红蛋白中的小分子杂质纯化纯化凝胶色谱法凝胶色谱法1.凝胶色谱柱的制作：凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：凝胶色谱柱的装填：教材图教材图5193.样品的加入和洗脱样品的
12、加入和洗脱注意：注意：（1 1）凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀；充分溶胀；凝胶装填时凝胶装填时尽量尽量紧密紧密；装填时；装填时不能有气泡存在：不能有气泡存在：因为气泡会因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 （2 2）装完后，立即用缓冲液洗涤，使凝胶）装完后，立即用缓冲液洗涤，使凝胶装填紧密装填紧密3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱 1.调液面调液面 2.加样加样 4.洗脱洗脱 5.收集收集缓冲液缓冲液凝胶凝胶注意：洗脱过程不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，注意：洗脱过程不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象， 否则重新
13、填装。否则重新填装。3.再调液面再调液面 1.调液面调液面 2.加样加样3.再调液面再调液面 4.洗脱洗脱 、 5.收集收集注意事项注意事项1. 红细胞的洗涤：红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2. 凝胶的预处理凝胶的预处理： 沸水浴法，还能除去微生物和气泡沸水浴法，还能除去微生物和气泡3.色谱柱的装填：色谱柱的装填： 装填尽量紧密；无气泡；洗脱液不能断流装填尽量紧密；无气泡；洗脱液不能断流。4. 色谱柱成功标志：色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动红色区带均匀一致地移动。知识总结知识总结血血红红蛋蛋白白的的提提取取和和分分离离蛋白质分子的差
14、异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法凝胶色谱法原原 理理分离过程分离过程凝胶电泳法凝胶电泳法缓冲溶液缓冲溶液组组 成成作作 用用蛋白质的蛋白质的提取分离提取分离样品处理样品处理粗粗 分分 离离 纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定1、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是白质的叙述，正确的是A、 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对 分子质量较大的蛋白质分子质量较大的蛋白质B、 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对 分子质量较大的蛋白质分子质量较大的蛋白质C、 相对分子质量较小
15、的蛋白质行程等于相对相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对 分子质量较大的蛋白质分子质量较大的蛋白质D、 二者根本无法比较二者根本无法比较练习巩固练习巩固2.2.相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个的进行过程可表示为图中哪一个B5、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少电荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差异分子形状的差异6.6.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，下列是有关血红蛋白提取和分离的相
16、关操作，其中正确的是（其中正确的是（ ） A A可采集猪血作为实验材料可采集猪血作为实验材料 B B用蒸馏水重复洗涤红细胞用蒸馏水重复洗涤红细胞 C C血红蛋白释放后应低速短时间离心血红蛋白释放后应低速短时间离心 D D洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液 A8.8.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是因是A A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱 次序，降低分离效果次序，降低分离效果B B、气泡阻碍蛋白质的运动、气泡阻碍蛋白质的运动C C、气泡与蛋白质发生化学反应、气泡与蛋白质发生化学反应D D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密9.9.样品的加入和洗脱的操作不正确的是样品的加入和洗脱的操作不正确的是A A、加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝、加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B B、加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内、加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C
