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1、第五章体外分析技术五十多年前，美国免疫学家Pressmen应用放射性碘标记抗原对抗原一抗体免疫反应进行了研究1950年).19531956年间美国生物学家BerSon和YaloW使用放射性碘标记蛋白质，进行蛋白质代谢的实验研究，其间他们发现应用外源性胰岛素治疗的糖尿病患者血清中存在着抗胰岛素抗体。接下来的进一步研究中他们发屈E标记抗原能竞争抑制标记抗原与抗体的结合,并可以从其结合能力检测出未知抗原的量，从而建立了一种新的检测方法(1959年)，这就是放射免疫分析法(radioimmunoassay,RlA)OYalow因此在1977年获得诺贝尔生物医学奖其时BerSon已病故)。1960年Ek
2、inS利用血清中的甲状腺结合球蛋白(TBG)和甲状腺素(TT4)具有特异结合的特点，建立了甲状腺素(TT4)的竞争蛋白结合分析(Competitiveproteinbindingassay,CPBA)o1963年Murphy等人进一步完善了这类技术,建立了血浆皮质醇竞争蛋白结合分析。1968年Miles和Hales用放射性核素标记抗体，用过量的标记抗体和待测物反应直接测定待测物的含量，建立了免疫放射分析法(immunoradiometricassay,IRMA)o1970年Lefkowitz在竞争抑制结合反应原理基础上,利用某些激素受体与激素呈现特异结合的特性，以组织受体为结合剂建立了放射受体
3、分析法。其后随着医学科学的进步，出现了应用放射性核素标记配基与特异的受体结合原理，建立了受体的放射配基结合分析(radioligandbindingassayofreceptors,RBA)简称受体放射分析(radioassayofreceptors)o体外放射分析法问世四十多年来，无论是方法学的研究，还是试剂的研制和生产都取得了显著的进步，目前已广泛应用于临床医学诊断和基础医学理论研究中，其检测的物质已达300多种，极大地推动了医学科学的发展，提高了临床诊断疾病的水平。在体外放射分析基础上发展起来的非放射免疫分析技术，如化学发光分析、时间分辩荧光免疫分析等更是以自动化程度高、稳定性好、无放射
4、污染、结果准确等优点，日益受到临床的重视，促进了体外分析技术更加成熟和广泛实用。第一节体外放射分析一、基本原理体外放射分析是指在体外条件下，以结合反应为基础，以放射性核素标记物为示踪剂，以放射测量为定量手段，对体内微量物质进行定量检测的技术总称。包括所有以体外放射分析的基本原理为基础而建立起来的各种体外分析技术,主要包括放射免疫分析、免疫放射分析、受体放射分析等。其方法和种类繁多，不可能也不必全部介绍，本章仅就临床常用的几种体外放射分析技术的原理和方法作一阐述。(一)放射免疫分析放射免疫分析(radioimmunoassay,RlA)是体外放射分析技术中建立最早、应用最广泛的一类技术，其基本原
5、理是利用待测抗原与标记抗原同相应的特异性抗体的竞争结合。在免疫结合反应中，抗原与抗体的结合在一定条件下是呈双向进行的，既能结合成抗原抗体复合物，又可离解为游离的抗原和抗体，这种可逆性结合与多种因素相关。放射免疫分析技术就是在抗原抗体的结合反应中，加入放射性核素标记的抗原，其与有限量的特异性抗体发生竞争结合，这种竞争可以用如下反应式来表达:式中*Ag表示标记抗原，Ag表示待测抗原或标准抗原，Ab表示特异性抗体，*AgAb表示标记抗原抗体复合物,AgAb表示非标记的待测抗原抗体复合物。当这个反应体系中同时存在*Ag、Ag和Ab,而*Ag和Ab是有限量时，则形成的*AgAb复合物的多少取决于Ag的量
6、，随着Ag量的增加，*AgAb的量就会相应减少即与Ag的量呈负相关。当反应达到平衡后揩反应体系中的*AgAb与游离的*Ag分离，测定其放射性。如果在不同试管中分别加入已知系列浓度的标准抗原（Ag）在同样条件参与反应,获得各标准浓度管的*AgAb量（结合率）,并以已知标准抗原的浓度为横坐标，以*AgAb复合物的结合率（如B/T、B/F或F/T）为纵坐标，可绘制出剂量反应曲线，即为标准曲线或竞争性抑制曲线（图5-l)o图5-1放射免疫分析标准曲线这条剂量反应曲线明确反映了剂量与标记抗原抗体复合物之间的负相关关系,有了该标准曲线，则根据待测样品管的*AgAb（结合率）即可刻度出待测抗原的含量。放射免
7、疫分析具有灵敏度高、特异性强、重复性好、准确度高等特点，应用范围广泛，可测物质包括蛋白质、多肽激素、病毒抗原、肿瘤相关抗原、维生素、环磷酸腺昔、小分子物质和某些药物浓度等。（二）免疫放射分析免疫放射分析（immunoradiometricassay,IRMA）是将放射性核素标记在抗体上，然后以过量的标记抗体与待测抗原结合，将标记的抗体抗原复合物（Ag*Ab）与未结合的标记抗体分离，通过放射测量可求得待测抗原的含量。免疫放射分析标记的是过量抗体,反应系统是非竞争性的全量结合反应,如下式所示：Ag+*AbAg*Ab+*Ab式中Ag表示待测抗原JAb表示标记抗体。当*Ab过量加入反应体系中时，可斗的
8、测抗原全量结合,通过一定手段分离复合物与剩余的标记抗体，并测量复合物的结合率。同样，以已知含量的抗原参与结合反应制作一条标准曲线（即剂量反应曲线，图5-2）通过该标准曲线可以刻度待测抗原的含量，这条标准曲线反映剂量与标记抗体抗原复合物结合率为正相关关系，即复合物的结合率随着待测抗原的含量增加而增加。图5-2IRMA剂量反应曲线免疫放射分析较之放射免疫分析技术具有许多优势，首先IRMA系统中标记抗体，不会改变抗原的免疫活性，而抗体是大分子蛋白，含有多个酪氨酸，标记抗体比标记抗原更容易且稳定；其次IRMA使用过量抗体，反应迅速，应用固相技术容易分离，操作简便；更重要的是，目前越来越多开展的双位点I
9、RMA使用了针对不同抗原决定簇的两种抗体，尤其是采用了纯化抗体或单克隆抗体，避免了交叉反应,特异性和灵敏度(包括测量范围)都大大提高,精密度也优于RIA0双位点夹心法是1971年Addison建立的，其做法是先将抗体包被在固相载体上制成固相抗体，然后与待测抗原结合，生成固相抗体一抗原一标记抗体复合物，溶液中未被结合的剩余标记抗体予以洗去，避免了离心分离的繁琐，检测更加方便、可靠。(三)受体放射分析受体放射分析(radioassayofreceptors)又称为受体的放射配基结合分析(radioligandbindingassayofreceptors,RBA)是目前研究受体亲和力和受体数量最基
10、本、最主要的方法。它是应用放射性核素标记配体与特异的受体结合，测定受体的亲和力和数量，也可用作研究受体亚型的方法。基本方法是用放射性核素标记配体，然后在反应系统中与相应的组织、细胞或含有受体的制剂一起温育，使受体与标记配体充分结合，形成受体一标记配体复合物，终止反应后，采用一定方法分离并去除未被结合的标记物，测定结合部分的放射性，根据加入标记配体的化学量即可计算出待测受体的最大结合容量。如下式所示：R+*LR*L+*L式中R为受体,*L为已知量的标记配体,R*L为受体与标记配体结合的复合物。受体与配基的结合也服从质量作用定律，对某种受体而言，它的全部都以相同的亲和性以单分子与特定的配基相结合,
11、理论上讲结合后产生的生物效应也应完全相同，尽管亚型的生物效应可能不全相同,结合反应却表现出完全相同的特性。受体与配基的结合并非线性关系，而是曲线关系。配体数量从零开始上升时，复合物数量先是上升很快，以后逐渐变慢，最后绝大多数受体都变成复合物，也就是受体被饱和了，形成饱和曲线（图5-3）,曲线的高度主要反映受体的数量，曲线上升的快慢则主要反应受体与配基的亲和力（亲和力越大，上升越快）。图5-3受体数量固定,亲和力固定时,复合物浓度和配基浓度的关系TB代表总结合，SB代表特异结合，NSB代表非特异结合受体放射分析具有灵敏度高,特异性强,专一性好等特点，放射性核素标记配基一般不会改变其结合的生物活性
12、。受体制剂还有多用性，同一组织和细胞上有不同的受体，因此某种组织的制剂可用多种配基作受体结合分析，而且受体的种属选择性不强，人和动物间的受体存在相容性，用动物的受体制剂多数可以用于研究人类的相应配体。二、基本方法体外放射分析有多种类型，无论哪一种类型，其方法都离不开试剂的制备（包括放射性核素标记物、待测物、标准品和结合剂）,反应条件的确定,结合与游离部分的分离,建立标准曲线并刻度出待测物含量等几个基本环节。为了阐述方便，本节主要以经典的放射免疫分析法介绍。（-）试剂的制备L标记抗原或抗体在体外放射分析中，放射性标记物主要是指标记抗原、抗体或配体，不同的分析类型其标记的对象也不同，最常用的标记核
13、素是1251,测量仪器为g计数器，有时也采用发射b射线的3H作标记，但需用液体闪烁计数器测定。对体外放射分析而言,125I是最有价值的核素，其半衰期适中（约60天），既易于商品化与贮存，又有利于废物的处理；si只发射低能的Y射线（28keV和35keV）,容易测量，辐射自分解小，其标记物有足够的稳定性；另外碘的化学性质活泼,标记容易,设备简单。因此，I?的标记物在体外放射分析中得到最广泛的应用。对放射性标记物的质量要求主要是四个方面：(1)比活度(specificactivity)比活度越大，表明标记物的用量越小，只有标记物的用量等于或低于被测物的最小量，才能得到较好的灵敏度，标记物的化学用量
14、越小,分析的灵敏度越高,但同时还需使每一反应管中有足够的放射性活度，以减少测量误差，因此高比活度的标记物是确保分析方法灵敏度的前提。但比活度受标记制备方法的限制,而且还应注意每一分子上过多的标记原子会影响标记物的免疫活性和稳定性。(2)免疫活性(immuneactivity)在标记物的标记、储存过程中，许多因素和外界条件的变化都可以造成标记物的损伤，使标记物失去免疫活性。常用的免疫活性检测方法如下：在一组试管中加入一定量的抗体、标记抗原和不同浓度的标准抗原进行反应制备剂量-反应曲线在另一组试管中以不同量的标记抗原(与前一所加的标准抗原量相等)代替标准抗原。如果标记抗原的免疫活性未受损伤，则标记
15、抗原与抗体的亲和能力不会变化，由于是以等量的标记抗原代替标准抗原,两个反应体系的初始抗原总量(包括标记抗原和未标记抗原)和抗体量是相等的，反应达到平衡后的抗体浓度是相等的，由于亲和常数不变，所以B/F值相等，因此两条曲线应该重合。但由于标!己抗原定量的误差，两条曲线常表现为相互平行。如果两条曲线分离或交叉，说明标记抗原的免疫活性受到某种程度的损伤。造成免疫活性损伤的主要因素有：1在蛋白质中引入碘原子代替氯原子时使分子结构发生变化而引起碘化损伤。2标记在蛋白质分子的放射线使蛋白质成为碎片引起放射损伤。3碘化反应时氧化反应和还原反应引起的化学损伤。4随着贮存时间的延长，标记蛋白质的聚合、脱碘等导致
16、标记抗原质量下降。(3)放射化学纯度(radiochemicalpurity)放射化学纯度是指该标记物的放射性活度占标记产物总放射性活度的百分率。一般要求标记物的放射化学纯度在95%以上，若放射性杂质过多，标准曲线的斜率降低，将会影响测定的灵敏度。(4)稳定性(stability)稳定性是指标记抗原在合理储存的条件下，保持其全部性能不变的程度。许多因素都可以影响其性能的稳定性,如标记方法、标记位置、置换水平，理化环境等都会使放射性核素从放射性标记抗原的分子上脱落下来,或造成标记分子聚合或分离，使放化纯度明显下降。2.结合剂在体外放射分析中，可作为结合剂的主要有抗体、受体和某些蛋白质物质。(1)抗体抗体和抗血清是放射免疫分析中极为重要的试剂，其质量好坏直接影响分析的灵敏度和准确性。传统获得方法是用经过纯化的免疫原在动物身上人工免疫，获得一定的特异血清，分子量超过5000的蛋白多肽类物质具有较
