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1、福建农林大学大学生创新创业训练计划项目结题报告书项目编号：项目名称：基于基因组编辑的大黄鱼抗病育种项目负责人：（）汤凯杰项目组成员：（）张纪元项目主持学校：福建农林大学指导教师：O邵光明填表日期：二O二二年五月一、项目基本彳言息项目编号项目类型创新训练项目立项时间2021-08结题时间2022-05资助经费8000.00支出经费0.00二、项目组成员信息负责人姓名学号班级专业学院项目分工汤凯杰19水产1班水产养殖学动物科学学院（蜂学学院）组员张纪元19水产1班水产养殖学动物科学学院（蜂学学院）三、指导教师信息指导教师姓名学历职称单位研究方向（）邵光明研究生讲师动物科学学院（蜂学学院）大黄鱼抗病
2、育种四、项E情况（不少于IoOO字）项目目标任务：由变形假单胞菌引起的内脏白点病是限制大黄鱼产业发展的最.主要瓶颈之一。本团队前期率先建立了大黄鱼基因组编辑技术，并发现：抗菌肽LCHamP2-5对变形假单胞菌具有强烈的杀菌作用并降低大黄鱼感染后的死亡率。此外，abu-miR-15c-5p可以靶向抑制LcHamp2-5基因表达。因此，本团队拟进一步研究该miRNA在抗变形假单胞菌感染中的作用，并通过基因组编辑技术获得miRNA敲除的抗病品系。完成情况：揭示了abu-miR-15c-5p在大黄鱼抗变形假单胞菌感染中的功能，但基因编辑在开展的过程中遇到了一些问题-SgRNA试剂盒转录得到的SgRNA
3、体外不具有切割活性，后来发现是试剂盒出了问题，中间查找原因花费了太多时间。尚未获得miRNA敲除的大黄鱼抗病新品系。项目名称基于基因组编辑的大黄鱼抗病育种实施过程：双荧光素酶报告实验验证abu-miR-15c-5p对LCHamP2-5的靶向作用。方法是：合成abu-miR-15c-5p模拟物，并将LcHamp2-5的3UTR构建入pmirGLO载体中萤火虫荧光素酶基因的3端,形成miRNA报告质粒，NC为共转染miRNA报告质粒和对照miRNA到293T细胞的对照组。abu-miR-15c-5p共转染miRNA报告质粒和abu-miR-15c-5p模拟物到293T细胞的实验组。结果显示abu-
4、miR-15c-5p可以显著降低萤火虫荧光素酶报告基因的表达，表明abu-miR-15c-5p可以靶向作用于LCHamP2-5的3,UTRo该结果支持了我们之前的双荧光素酶实验结果。构建了LCHamP2-5种子序列结合位点突变的突变型报告质粒。为了研究abu-miR-15c-5p抑制LcHamp2-5表达的分子机制，我们成功构建了LcHamp2-5种子序列结合位点突变的突变型报告质粒。为了进一步确定abu-miR-15c-5p对LcHamp2-5靶向作用，我们构建abu-miR-15c-5p种子序列结合位点突变的突变型报告质粒即Hep2-5-mut,转染abu-miR-15c-5p+Hep2-
5、5-mut组的相对荧光活性平均值略低于转染POl-miR-NC+Hep2-5-mut组，但两者之间的没有显著性差异。而转染abu-miR-15c-5p+miRNA报告质粒的293T细胞组向对于对照组即转染pol-miR-NC+miRNA报告质粒显著下调，该结果进一步验证之前的结果。qRT-PCR和miRNA表达技术在大黄鱼头肾原代细胞过表达abu-miR-15c-5p验证其对LcHamp2-5基因表达的影响。合成abu-miR-15c-5p的miRNA抑制物，腹腔注射miRNA抑制剂，揭示miRNA在大黄鱼抗变形假单胞菌感染中的功能。创新特色：大黄鱼(LarimiChthySCrOCea)是我
6、国特有的地方性经济鱼类，2019年其产量达22.55万吨，是我国人工养殖年产量最高的海水鱼类。然而，近年来由变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)弓I起的内脏白点病导致大黄鱼大批的死亡，而且该病病情呈逐年加重的趋势。因此，迫切需要通过遗传改良的方式提高该物种的抗病能力。基因组选育已经被用于大黄鱼的育种实践，如增强大黄鱼对刺激隐核虫的寄生抵抗力，改善生长性状等。基因组选育可以显著提高选育的准确性。然而，基因组选择育种技术受限于靶性状的遗传力，亲本的遗传变异和高昂的成本。而基因组编辑育种可以高效地向基因组引入有利的变异，为这些局限提供了新的解决方法，并在水产养殖性状的
7、遗传改良方面具有巨大的潜力。基因组编辑可以通过多种方式实现，目前使用最广泛的是基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术。活体CRlSPR/Cas9基因组编辑普遍采用的是向胚胎显微注射人工设计的SgRNA(smallguideRNA)和Cas9核酸内切酶mRNA的混合物，或者直接注射SgRNA/Cas9蛋白的核糖核蛋白复合物到胚胎中。SgRNA可以识别基因组中特定的序列，并引导Cas9核酸内切酶切割特定的DNA双链，断裂的双链会在机体的修复系统-非同源性末端连接(Non-homologousendjoining,NHEJ)的作用下产生碱基的插入或者缺失，造成移码突变，从而实现基因敲除。目前基于
8、CRlSPR/Cas9的基因组编辑技术已经被广泛地应用于鱼类特别是淡水鱼类，如鲤(CyPrinUSCarPio)、银鲫(CaraSSiUSgibelio)、斑点叉尾蒯(Ictaluruspunctatus)等鱼类的遗传改良或基因功能研究。然而，由于大多数的海水鱼卵壳坚硬，卵浮性等问题基因组编辑技术仅在少数的海水鱼类中获得了成功。此外，大黄鱼受精卵对温度、溶氧量以及显微注射产生的机械损伤的高度敏感性也增加了基因组编辑技术在大黄鱼中的建立难度。团队通过技术改良率先建立了大黄鱼的显微注射技术和基因组编辑技术，这为基于基因组编辑的大黄鱼抗病育种提供了技术支撑。收获及体会：通过本次大创训练，学习了基于C
9、RlSPR/Cas9的基因组编辑技术，提取RNA,荧光标记等技术。学会了很多实验仪器的使用，以及他们的实验原理，提高了我们的科学素养。这次项目感谢老师和师姐的帮助。这次创新训练我们收获颇多，受益匪浅，我们认为这是一次成功的有用的创新训练，不仅使我本科期间的一段难忘的经历，也是人生中的一次宝贵的财富，感谢学校给予了这一次锻炼的机会。五、项目成果形式及数量项目申请书中的预期成果1、揭示abu-IniRT5c-5p在大黄鱼抗变形假单胞菌感染中的功能。2、获得IniRNA敲除的大黄鱼抗病新品系。项目结题时取得的成果1、揭示了abu-miR-15c-5p在大黄鱼抗变形假单胞菌感染中的功能。项目成果明细：
10、（要求附上相应证明材料旦匕复印件,实物可以用照片等形式存档）1.文献资料综述（）份；2.调查报告（）份；3.研究论文（）篇；4.口软件（）个：5.口设计（）份；6.硬件研制（）件；7.获得专利（）份；8.心得体会（）份；9./其他（1）件，其他：研究报告。六、项目经费使用情况序号经费科目金额（元）备注1234（根据实际情况增行）合计O暂未使用七、项目实施过程中存在的问题和建议今年的大黄鱼病害非常严重，我们从宁德市富发水产有限公司鱼排上购买了多批大黄鱼,由于内脏白点病、体表白点病和涡虫感染等原因，大黄鱼上岸没有多久几乎死光，也尝试了用甲醛消毒处理，但是仍未解决，这为后续的实验开展带来的困难，后面
11、会努力寻找解决方案。八、诚信承诺本项目小组郑重声明:所呈交的项目内容（包括文献资料综述、研究或设计方案论证材料、经整理归类的原始记录、发表论文、论文或设计报告、研究报告、实物、软件、专利、心得体会、电子展板等各项成果支撑材料和相关的电子文档即光盘），是本小组在相关老师的指导下，小组全体成员合作进行研究工作所取得的成果。项目内容所包括的文献、数据、实物、图片、软件、专利等资料均已经注明引用及其出处，对本项目成果的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在项目内容中以明确方式表明。本小组全体成员完全意识到本声明的法律后果，项目内容如有因抄袭而造成的违规侵权之处，本小组全体成员愿意承担相应的法律责任。主持人签名：汤凯杰项目组其他成员签名：张纪元2022年5月1日九、项目评定指导教师意见本项目首先利用双荧光素酶报告实验进一步验证了abu-miR-15c-5p对LcIIamp2-5的靶向作用。随后通过miRNA的反义核酸技术在大黄鱼细胞水平揭示了abu-miR-15c-5p对LcHamp2-5表达调控。该研究将为基于基因组编辑的大黄鱼抗病育种奠定基础。汤凯杰和张纪元两位学生在实施该项目时认真负责，积极开展了实验，当实验遇到困难时，能够认真思考、主动分析问题的原因、积极和其他学生和老师沟通，并取得了相关的实验结果。指导教师签名：部先期2022年5月1日
