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1、细胞内氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)主要用途细胞内氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂是一种旨在通过二甲基4亚硝基苯胺，受到单线态氧气一的作用，出现去色现象，由分光光度仪比色分析，定量检测细胞内单线态氧气活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。其适用于各种活体细胞(动物、人体等)内单线态氧气的检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。技术背景超氧自由基阴离子(6UPerOXideradiCaI；O2过氧化氢(hydrogenperoxide
2、；H2O2)、羟自由基或氢氧基(hydroxylradical；0H)、过氧化基(eroxylradical；R00氢过氧自由基(hydroperoxyl；HOO烷氧自由基(alcoxy!radical).氮氧基(niiricOxide；NO)、过氧亚硝基阴离子(PerOXyniIrileanion；ONOO)次氯酸(hypochlorousacid；HCl0)、半酸自由基(SemiqUinoneradiCaI)、单线态氧气(Singletoxygen)等细胞内活性氧族(ReaciiveOxygenSpecies;ROS)的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。其中单线态氧气(SinglelOXy
3、gen；I02)是分子轨(O2)的抗磁形式或电激发形式。通过染料分子，例如孟加拉红(RoSeBengal),亚甲基兰(MelhyIeneBIue)、吓咻类化合物(PorPhyrinS)染料的光敏过程中能量转移产生，或过氧化氢和次氯酸的化学反应产生。单线态氧气可以调节紫外线A辐射的生物学作用、激活各种细胞信号通路等。单线态氧气会导致植物的光动力损伤(photodynamicdamage)和动物心血管问题。基于二甲基4.亚硝基苯胺(NH-DimeihyLp-Iiiirosoaniline;PNDA或RNO)作为单线态氯气的选择性受体，在单线态氧气的存在下，产生去色作用，在分光光度仪下(44Onm波
4、长)，呈现吸光峰值的降低。据此定量检测细胞内单线态氧气活性氧族的浓度。产品内容清理液(ReagenlA)120亮升裂解液(ReagenlB)10受升缓冲液(ReagentC)20受升反应液(ReagenlD)2克升阴性液(ReagenIE)1克升产品说明书1份保存方式保存清理液(ReagenlA)在4C冰箱里；其余的保存在-20C冰箱里：反应液(ReagentD)避免光照；有效保证6月用户自备1.5克升离心管：用于样品制备和保存的容器15亳升锥形离心管：用于样品制备的容器细胞刮脱棒：用于细胞脱离（微型）台式离心机：用于样品操作培养箱：用于反应孵育比色皿或96孔板：用于比色分析的容器分光光度仪或
5、酶标仪：用于比色分析实验步骤一、样品准备1 .准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5XIO6细胞）2 .小心加入3亳升清理液（ReagentA）,覆盖生长表面3 .小心抽去清理液4 .使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）5 .加入3亳升清理液（ReagentA）,混匀细胞6 .移入到预冷的15亳升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）7 .放进4七台式离心机离心5分钟，速度为300g8 .小心抽去上清液9 .加入500微升裂解液（ReagentB）,充分混匀10 .转移到预冷的1.5克升离心管11 .强力涡旋震荡15秒12 .置于冰槽里孵育30
6、分钟13 .放进4七微型台式离心机离心15分钟，速度为160OOg（或13000RPM,例如eppendorf5415）14 .小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5克升离心管15 .移取10微升进行蛋白定量枪测（注意：建议使用BradfOrd蛋白质浓度定量试剂盒一GMS30030.1）16 .即刻放进一70C保存或置于冰槽里继续后续操作二、测定准备1 .开启并设定好分光光度仪（温度为30P）：波长440nm,并置零2 .从一20C冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液（ReagentD）避免光照3 .缓冲液（ReageiltO室温卜均衡温度三、背景对照测定1 .移取800微升缓冲液（Re
7、agentC）到新的比色皿2 .加入100微升阴性液（ReagentE）3 .加入IOo微升反应液（ReagentD）4 .上卜倾倒数次，混匀5 .在30温度卜.孵育40分钟6 .即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照四、样品测定1 .移取800微升缓冲液（ReagentO到新的比色皿2 .加入100微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清澈）3 .加入100微升反应液（ReagentD）4 .上下倾倒数次，混匀5 .在30温度卜.孵育40分钟6 .即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数五、计算样品浓度（样品读数一背景读数）Xl（体系容量；亳升）X样品稀释倍数0.1（样品容量；率升）X34.
8、4（受摩尔吸光系数）=微摩尔02/亮升（样品蛋白浓度）亳克/亳升=微摩尔10克克六、酹标仪测定1 .在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品2 .分别移取200微升缓冲液（ReagentC）到96孔板的所有孔里3 .分别加入25微升阴性液（ReagentE）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）4 .分别加入25微升反应液（ReagentD）到96孔板的所有孔里5 .轻轻摇动96孔板6 .在30温度卜.孵育40分钟7 .即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数8 .浓度计算：（样品读数一背景读数）X0.25（体系容量；亮升）X样品稀释倍数0.025（样品容量；亳升）X34.4（亳摩尔
9、吸光系数）X0.6（光径距离；厘米）=微摩尔IO2/克升（样品蛋白浓度）亮克/亳升=微摩尔I6/亳克注意事项1 .本产品为20次（比色皿）或80次（96孔板）操作2 .避免使用叠氮化钠处理样品3 .操作时，须戴手套4 .孵育时，避免光照5 .系统操作过程中，背景测定只需1次6 .建议使用比色皿测定7 .样品须澄清，至关重要8 .测定值由高到低变化9 .比色测定后，比色皿须清洗彻底10 .建议待测样本蛋白浓度为50微克/100微升；如果样本浓度过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供Bradford蛋白质浓度定量试剂盒一GMS30030.1）11 .如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度12 .可以使用单线态氧气抑制剂或清除剂（SCaVenger）,即NaN3和DABCO作为抑制剂对照或阴性对照13 .可以使用单线态氧气激发剂（generator）,即蔡咤酮酸（NalidiXiCaCid）等作为阳性对照14 .本公司提供系列活性氧检测试剂产品质量标准1 .本产品经鉴定性能稳定2 .本产品经鉴定检测敏感
