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1、2022肠道菌群参与新生儿坏死性小肠结肠炎发病机制的研究进展(全文)摘要新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)是常发生于早产儿的肠道急症，肠道菌群失调可能是其病因之一。NEC患儿发病前后的肠道菌群均不同于健康儿。虽然尚未发现NEC的特定致病菌及相关代谢产物，但潜在致病菌及代谢产物如短链脂肪酸、石胆酸、色氨酸衍生代谢物等或在NEC中起着保护或促进作用。靶向调控肠道菌群如益生菌、粪便菌群移植等可以通过改变肠道菌群构成，从而起到防治NEe的作用。另外,NEC的早期症状和体征不典型且临床诊断较为困难，一旦确诊往往即为重症，基于菌群寻找合适的标志物对于NEC的早期诊断可能具有重要意义。新生J诉死性小肠结肠炎(
2、necrotizingenteroco1.itis,NEC)是早产儿最常见且最严重的胃肠道急症，是早产儿致死、致残的重要疾病之一。随着围生医学的进步，早产儿存活率逐年增加，但NEC发病率及病死率居高不下。新生儿NEC总病死率高达23.5%1,在极低出生体重婴儿中，其发病率约7.6%2,病死率高达40.5%1.存活患儿常留有诸多后遗症，其中肠衰竭发生率为15.2%35.0%,神经发育障碍的发生率为24.8%-61.1%1.;且NEC患儿平均智商较低。因此，阐明NEC发病机制，针对性防治NEC对于降低早产儿病死率及改善NEC患儿预后十分重要。目前认为NEC发病机制与多种因素有关，如早产、配方奶粉喂
3、养、长时间抗生素暴露、细菌定植异常、缺血再灌注损伤等，但尚无确切定论。NEC从不在子宫内发生，且NEC样病变在无菌动物体内很难诱导；NEC患儿的肠道菌群多样性降低，益生菌、粪菌移植有防治NEC的作用，提示NEC可能存在菌群异常。本文就肠道菌群参与NEC发病机制的研究进展作一综述。1肠道菌群的影响因素1.1 喂养方式喂养方式对生后第一年的粪便微生物组和代谢组有着很大影响3o母乳中含有多种低聚糖，促进早产儿特定微生物的定植和富集，增加菌群多样性，是新生儿肠内喂养的首选4。捐赠母乳儿的肠道微生物群与母乳喂养儿相似，但仍存在差异。与捐赠母乳喂养的早产Jq目比，在门水平上，亲乳喂养组的厚壁菌门相对丰度较
4、低、放线菌门相对丰度较高；在科水平上，双歧杆菌科丰度更高、梭状芽胞杆菌科丰度更低；在属水平上，双歧杆菌属和肠杆菌未分类属水平更高、柠檬酸杆菌属和梭菌科未分类属水平更低5。不同喂养方式的婴儿肠道菌群多样性具有差异，门水平上配方喂养儿的厚壁菌门相对丰度高于亲乳和捐赠母乳喂养儿5,变形杆菌门、拟杆菌门及疣微菌门相对丰度存在差异；在属水平上表现为拟杆菌属、葡萄球菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌属、副拟杆菌属存在差异；生后第26天，亲乳喂养儿的肠道拟杆菌门的细菌总数、肠球菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属和乳酸杆菌属水平均高于配方喂养儿6。1.2 早产早产儿肠道菌群多样性低于足月儿，胎龄越小的早产儿，其肠道菌群定植越晚、
5、多样性越低7。KorPe1.a等8对45例早产儿的262份粪便样本进行16SRNA扩增序列分析发现，肠道菌群的发展呈阶段性，葡萄球菌、肠球菌、肠杆菌和双歧杆菌依次为各阶段的优势菌属，婴儿成熟度是肠道菌群发展尤其是达到双歧杆菌占优势的重要影响因素之一。足月儿在属水平上，每个时间点均检测到双歧杆菌，而晚期早产儿出生后一周内双歧杆菌在属/种水平上均显著低于足月儿，且肠道菌群定植进展缓慢，晚期早产对生后6个月的肠道菌群发育亦具有独立影响9。此外，围生期抗生素暴露显著延迟肠道菌群定植，导致早产儿粪便中缺乏双歧杆菌属10,从而进一步降低早产儿肠道菌群多样性7,10,分娩方式、产前并发症与肠道菌群失调存在关
6、联10,11。2NEC中肠道菌群变化目前尚无NEC的确切致病菌报道，但与未患NEC相比，NEC发病前和诊断后均存在菌群失调的典型特征12,13,14,15,16,17,18。NEC发病前肠道菌群在门水平上，变形菌相对丰度增加、厚壁菌和拟杆菌相对丰度降低14;在种/属水平上，长双歧杆菌相对丰度低、阴沟肠杆菌及芽泡杆菌和梭菌相对丰度较高16,18。发病前肠道中不与IgA结合的肠杆菌科丰度激增，而健康婴儿肠道的肠杆菌科丰度较低,且大部分与IgA结合15。NEC发病前2天，所有细菌尤其是肠杆菌科复制速率显著增加17。虽未发现NEC发病前的肠道菌群与其严重程度有关13,但在早发型NEC（7d发病）和晚发
7、型NEC（7d发病）中肠道菌群存在差异,早发型NEC发病前的粪便样本中狭义梭菌属丰度显著高于对照组，而晚发型NEC在发病前6天大肠杆菌及志贺菌呈显著增加趋势12。与健康对照组相比，NEc确诊后粪便样本中肺炎克雷伯菌丰度更高，产气荚膜梭菌普遍存在，肠球菌、链球菌、消化链球菌为优势菌属16,17,19;而对照组表现为厚壁菌门和乳酸杆菌更为丰富7,20。NEC发病前后均存在显著的肠道菌群失调，提示肠道菌群参与NEC的发生发展。3肠道菌群参与NEC的可能发病机制肠道菌群在健康和疾病中起到重要作用21。学者指出宿主-微生物群的相互作用可能是NEC发病的核心环节，早产儿细菌定植时肠道对微生物配体的高反应性
8、，继而引发一系列异常信号表达和黏膜炎症免疫反应22。菌群失调和NEC发病之间是一种复杂的动态关系有害菌”增加和”有益菌”减少均会导致肠道重要功能无法维系。3.1 To1.1.样受体4(to1.1.-1.ikereceptor4,T1.R4)参与NEC的发病目前未发现NEC的确切致病菌与代谢产物但潜在致病菌的检出率较高，如尿路致病性大肠杆菌23、产细胞毒素性肺炎克雷伯菌24,提示一系列潜在致病菌可能共同导致NEC的发生。T1.R是一类典型的模式识别受体，可以直接识别并结合病原体相关模式分子，引发下游信号传导，导致炎性细胞因子和趋化因子的释放，T1.R4是介导脂多糖应答最主要的受体之一，识别革兰阴
9、性杆菌上的脂多糖，在机体的天然免疫防御中发挥着重要的作用。HUi等25发现，NEC患儿切除肠段的革兰阴性杆菌含量显著高于对照组，T1.R4在NEe患儿和小鼠的肠黏膜表达均增加，T1.R4突变型C3HHeJ小鼠对NEC有保护作用26。提示NEC与肠道黏膜T1.R4表达增加有关，T1.R4过度激活是早产儿肠道损伤与修复失衡的关键途径之一26。肠道菌群失衡可能是持续过度炎症反应的“触发器”，最终导致肠道结构和组织损伤。3.2 NEC中肠道菌群相关代谢产物的作用机制肠道菌群可产生大量代谢产物与宿主相互作用，抑制过度的炎症反应，维持肠道稳态，缺乏这些保护性作用可能导致不受控的炎症反应JSftNEC的发生
10、。短链脂肪酸如丁酸盐等由肠道菌群消化饮食产生，通过调节先天免疫和适应性免疫细胞的产生、运输和功能，抑制早产儿肠道内过度的炎症反应27。Wa1.ker等27指出母乳中复杂碳水化合物与脆弱拟杆菌相互作用产生短链脂肪酸，对NEC具有预防作用。但这一作用具有剂量依赖性：低剂量丁酸盐通过降低I1.-6和NF-KB表达，减轻NEe小鼠的肠道损伤，而高剂量丁酸盐可能诱导严重的肠上皮细胞凋亡、破坏肠屏障28。胆汁酸可调节肠道菌群的组成，同时在肠道菌群作用下转化为次级胆汁酸,Huang等29证实次级胆汁酸石胆酸通过活化上皮细胞的孕烷X受体M低T1.R4mRNA稳定性减少T1.R4表达，减轻NEC小鼠的肠道炎症。
11、此外，胆汁酸代谢过程中需要具有7-脱氢酶活性的共生菌参与，梭状芽泡杆菌和拟杆菌的部分菌株具有7-脱氢酶活性30。McMurtry等31发现NEC病变程度越重，梭状芽泡杆菌相对丰度越低，轻度、中度和致死性NEC中梭状芽泡杆菌的平均丰度分别为12%、3%和0,提示NEC患儿肠道梭状芽泡杆菌的减少可能通过抑制胆汁酸代谢削弱了孕烷X受体的抗炎作用，继而促进NEC的发生发展，靶向孕烷X受体可能是预防NEC的新途径。4靶向肠道菌群防治NEC4.1 益生菌补充益生菌可以有针对性地调控肠道菌群，特定益生菌的联合使用能显著降低早产儿NEC的发病风险，且无不良事件发生32。一项针对15712例早产儿的63项随机对
12、照试验的荟萃分析发现：乳杆菌+双歧杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、罗伊乳杆菌、鼠李糖乳杆菌，分别将严重NEC的发病风险降低65%、69%、45%、56%33,益生菌亦可降低婴儿病死率和感染风险32。尽管具有诸多益处，目前证据显示益生菌不能阻止NEC从I期到II期的恶化34,对神经发育障碍无显著改善作用35,补充益生菌难以长期改变婴儿的肠道菌群，停止补充后菌群很快恢复原状36。目前研究主要集中在单株益生菌或多株联合补充对NEC的防治作用，缺乏机制方面的研究。Fan等37从健康婴儿粪菌中分离出脆弱拟杆菌ZY-312,证明ZY-312在体外和新生大鼠模型中抑制坂崎克罗诺杆菌对肠上皮细胞的黏附入侵、恢复肠上
13、皮屏障功能、减少促炎细胞因子表达、增强抗炎细胞因子表达、抑制炎性小体通路激活和细胞死亡(焦亡+凋亡)，同时调节肠道菌群的构成减少变形菌门和Y变形菌纲、增加拟杆菌和芽抱杆菌属的相对丰度。研究证实罗伊乳杆菌DSM17938由T1.R2介导，可以降低肠道促炎细胞因子I1.-1.和IFN-Y水平,预防新生小鼠NEQ38。但目前益生菌往往作为膳食添加而不是临床治疗手段干预NEC,需要深入研究来阐明益生菌的确切作用机制，明确菌株及剂量，希望做到精准防治NECo4.2 粪便菌群移植(feca1.microbiotatransp1.antationfFMT)FMT能够纠正肠道菌群失衡、恢复菌群构成及功能,近年
14、来在炎症性肠病、癌症、代谢性疾病及NEC中都有治疗作用39。在NEC小鼠中，FMT能降低炎症细胞因子水平、改变微生物菌群、调节淋巴细胞比例、抑制肠道细胞凋亡、减少细菌移位，从而减轻NEC相关的肠道损伤40。Prado等41也证实FMT对于NEC诱导前后的小鼠，均具有降低肠道炎症损伤的作用。此外，FMT在不影响细菌总负荷的情况下，通过氧化应激调节增加早产猪结肠中专性厌氧菌的相对丰度；FMT影响碳水化合物的代谢，从乳酸到丙酸盐的产生，从而提高了结肠PH值；与对照组相比，FMT组肠道T1.R4表达也显著降低42。虽然FMT治疗NEC的潜力巨大但1.iu等43发现FMT灌胃增加了小鼠的回肠末端炎症，不
15、能改善NEC的组织学损伤，口服并直肠FMT增加了早产猪总病死率42。FMT对NEC的治疗效果可能受到静脉注射抗生素的影响，故不建议静脉注射抗生素和FMT联合使用治疗NEC44o菌群与NEC的因果关系尚不明确，需要更多研究以明确不同FMT给药途径带来的不同疗效并指导临床治疗。5生物标志物NEC一旦诊断往往为重症，且存活患儿出现诸多并发症，如何精确预测NEC是目前研究热点之一。考虑到肠道菌群或许参与NEC的发生发展,O1.m等17选取160例早产儿，对NEC患儿及健康对照组进行了宏基因组分析，利用细菌复制速率、KEGG模块、次级代谢物基因簇等特征进行机器学习，发现细菌增长速率为NEC的最强预测因子
16、，提示细菌增长速率可能用于预测NEC及以后的微生物靶向治疗。二唾液酸乳-N-四糖(disia1.y1.1.acto-N-tetraose,DS1.NT)是母乳中的一种特定寡聚糖，能够显著缓解缺氧/冷刺激所致的新生大鼠NEC样病理损伤45。NEC患儿的DS1.NT水平低于对照组，且DS1.NT浓度较低与菌群成熟度降低有关，结合菌群数据和DS1.NT水平,NEC发病前的预测准确率可达87.5%,DS1.NT有望成为NEC非侵入性生物标记物18。Brehin等46研究发现NEC-I期患在生后第3个10天，其肠道菌群更容易与对照组区分。故如何建立风险预测模型和选择特定的时间窗均有待进一步深入研究。6小结与展望NEC的发生与肠道菌群失
