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1、第三十三章第三十三章 DNA复制复制提纲提纲一DNA复制的一般特征二参与DNA复制的主要酶和蛋白质三DNA复制的详细机制1.以大肠杆菌为代表的细菌基因组DNA的 “-复制”系统2.“滚环复制”系统3.D-环复制系统4.真核细胞的细胞核DNA复制5.古菌的DNA复制四DNA复制的高度忠实性五DNA复制的调节机制DNA复制的一般特征复制的一般特征以原来的DNA两条链作为模板，四种dNTP为前体，还需要Mg2作为模板的DNA需要解链半保留复制需要引物主要是RNA，少数是蛋白质 复制的方向始终是53 具有固定的起点 多为双向复制，少数为单向复制 半不连续性 具有高度的忠实性和进行性 DNA复制可能的三
2、种方式复制可能的三种方式由Meselson和Stahl设计证明半保留复制的实验被誉为生物学最美丽的实验Meselson 和和Stahl的证明的证明DNA半保留复制的实验流程半保留复制的实验流程 Meselson 和和Stahl的实验结果的实验结果Meselson与与Stalh在在42年以后在最初年以后在最初他们相遇的一颗树下重逢时的合影他们相遇的一颗树下重逢时的合影Taylor以蚕豆根尖细胞为材料、使用放射性同以蚕豆根尖细胞为材料、使用放射性同位素证明真核细胞位素证明真核细胞DNA也是半保留复制的实验。也是半保留复制的实验。某些生物某些生物DNA复制的引物序列复制的引物序列 证明证明DNA复制
3、的方向始终是复制的方向始终是53的末端终止实验的末端终止实验 DNA复制起始区的特征复制起始区的特征由多个短的重复序列组成；能够被多亚基的复制起始区结合蛋白识别；通常富含AT碱基对，这有利于DNA复制起动时的解链，因为AT碱基对含有的氢键数目低于GC碱基对。细菌和酵母细菌和酵母DNA复制起始区的特征复制起始区的特征复制叉的结构复制叉的结构电镜下真核生物电镜下真核生物DNA的多个复制叉结构的多个复制叉结构John Cairns的实验的实验复制开始时，将大肠杆菌放在含低剂量的3H-dT的培养基中培养几分钟；随后，将细菌转移到含高剂量的3H-dT的培养基中继续培养一段时间；最后，收集细胞，小心地裂解
4、以抽取其中的染色体DNA进行放射自显影。如果是单向复制，自显影图谱上银颗粒的密度应该是一端高、一端低；如果是双向复制，则应该中间是一段低密度的银颗粒，两侧是高密度的银颗粒。低密度银颗粒意味着这一段DNA属于复制起始区，高密度颗粒代表的是后来合成的。Cairns证明大肠杆菌证明大肠杆菌DNA双向复制的实验双向复制的实验Reiji Okazaki的实验的实验脉冲标记目的在于即时标记在特定时段内合成的DNA。脉冲追踪目的则是要弄清那些被标记上的DNA片段后来的去向。 Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验的脉冲标记和脉冲追踪的实验Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果分析的脉冲标记和脉冲追踪
5、的实验结果分析Okazaki的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果分析的脉冲标记和脉冲追踪的实验结果分析在复制叉中不连续合成的DNA片段称为冈崎片段，连续合成的DNA子链被称为前导链，不连续合成的DNA子链被称为后随链或滞后链。 参与参与DNA复制的主要酶复制的主要酶和蛋白质的结构与功能和蛋白质的结构与功能DNA聚合酶DNA解链酶单链结合蛋白DNA引发酶DNA拓扑异构酶DNA连接酶端聚酶（真核生物特有） DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶的全名是依赖于DNA的DNA聚合酶，就是以DNA为模板，催化DNA合成的聚合酶。DNA聚合酶是参与DNA复制的主要酶，该酶的许多性质直接决定了DNA复制的一些基本特征。D
6、NA聚合酶聚合酶反应通式： Mg2+ DNA + 引物-OH + dNTP DNA/引物-dNMP + PPi 5 3 随后的随后的 PPi迅速水解驱动反应的进行迅速水解驱动反应的进行细菌DNA 聚合酶 DNA pol I,II,III,IV和V真核生物DNA 聚合酶 DNA pol ,和以及更多Arthur Kornberg (1957)大肠杆菌细胞蛋白质提取物大肠杆菌细胞蛋白质提取物+DNA模板模板有无有无DNA合成合成?- dNTPs- Mg2+ (辅助因子辅助因子)- ATP (能源能源)- 游离的游离的3OH端端 (引物引物)体外测定体外测定DNA复制复制纯化得到纯化得到DNA聚合酶
7、聚合酶I 目前是目前是Standford大大 学医学院的终身教授学医学院的终身教授一条肽链至少具有三种不同的酶活性！不可思议!l53外切核酸酶l 35外切核酸酶l 53DNA聚合酶DNA聚合酶聚合酶IDNA聚合酶折叠成几个不同的结构域聚合酶折叠成几个不同的结构域 Hans Klenow 使用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶处理DNA聚合酶I，结果得到大小两个片段：大片段被称为Klenow片段或Klenow酶，含有大小两个结构域，其中小结构域具有35外切酶活性，大结构域具有53聚合酶活性；小片段只有53外切酶活性。 Tom Steitz等得到了Klenow酶的晶体结构 Klenow酶的晶体结构模型酶的晶
8、体结构模型 DNA聚合酶I所具有的53聚合酶和53外切酶活性的联合使用可导致一个具有切口的DNA分子发生切口平移。如果在切口平移反应中加入放射性标记的dNTP，则放射性标记的核苷酸会参入到重新合成的DNA链上，从而使DNA的一条链带上同位素标记。 切口平移切口平移1969年，John Cairns等人分离到一种大肠杆菌突变株其DNA聚合酶I活性只有野生型的1% (polA基因突变)突变体对UV辐射极为敏感其他一切正常细胞照常分裂结论结论: DNA聚合酶I不是大肠杆菌DNA复制的主要聚合酶DNA 聚合酶聚合酶I是不错，然而是不错，然而. J 速度太慢J 酶量太多J 进行性不够高聚合酶的进行性是指
9、一种聚合酶从与DNA模板结合到与模板解离的这段时间内催化参入到DNA链上的核苷酸数目。显然，DNA聚合酶的进行性越高，催化复制的效率就越高。聚合酶I的进行性平均值为20nt50nt，远远低于DNA复制的实际值。结论：一定有其他结论：一定有其他DNA聚合酶。生化学家很聚合酶。生化学家很快从快从polA突变体纯化到新的突变体纯化到新的DNA聚合酶聚合酶其他线索其他线索. . 在多种需要短DNA合成的过程中起作用 在DNA修复中起主要作用 在DNA复制中，去除RNA引物，并填补随后留下的空缺。DNA聚合酶聚合酶I的功能究竟是什么？的功能究竟是什么？对对DNA聚合酶聚合酶I更多的认识更多的认识为什么具
10、有35外切核酸酶? 充当校对的功能去除复制中错配的核苷酸，然聚合酶有机会重新合成正确配对的核苷酸聚合酶的活性中心和3-外切酶活性中心切换？添加碱基还是切除碱基？DNA聚合酶的聚合和校对聚合酶的聚合和校对 已在大肠杆菌中发现已在大肠杆菌中发现5种不同的种不同的DNA聚合酶聚合酶 1.DNAP I: 占聚合酶总活性的90%2.DNAP II: 在DNA修复中起作用(1999年得到证明)3.DNAP III: 主要的DNA复制酶 4.DNAP IV: 在DNA修复中起作用（在1999年发现）5.DNAP V:在DNA修复中起作用（在1999年发现） DNA聚合酶家族聚合酶家族“真正真正”的大肠杆菌的
11、大肠杆菌DNA复制酶复制酶快：1 000nt/秒/酶 进行性高： 500 000nt酶量合适精确温度敏感型突变体只能生存在允许温度（30）下，当温度上升到限制温度（45）时，大肠杆菌难以生存。究其原因，是因为编码聚合酶III 亚基的polC基因发生了突变，致使该酶对温度变化极为敏感。当环境温度超过30以后，就很容易变性而丧失活性，这时DNA复制不能正常进行；而在允许温度下，该酶的活性是正常的，DNA复制也很正常。 DNA聚合酶聚合酶III 其结构十分复杂其结构十分复杂!大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶III的亚基组成和功能分工的亚基组成和功能分工大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶III的结构
12、模型的结构模型DNA聚合酶聚合酶III全酶的滑动钳夹住双螺旋全酶的滑动钳夹住双螺旋DNA DNA聚合酶聚合酶I、II和和III的比较的比较性质IIIIII结构基因polApolBpolC分子量（k）10390130分子数/细胞40010010Vmax(参入的nt/秒)16202525010003-外切酶活性5-外切酶活性进行性（nt）320010 000500 000突变体表现型UV敏感、硫酸二甲酯敏感无DNA复制温度敏感型生物功能DNA修复、RNA引物切除DNA修复染色体DNA复制真核细胞的真核细胞的DNA聚合酶聚合酶已在真核细胞中发现至少15种以上的DNA聚合酶，除了5种发现较早的DNA聚
13、合酶、和以外，其它几种DNA聚合酶如聚合酶、和都有相关的报道，这些新发现的DNA聚合酶一般缺乏3-外切酶的活性（除外），因此没有校对的功能，它们主要参与DNA的跨越合成，以克服损伤对DNA复制的不利影响。 真核细胞真核细胞DNA聚合酶聚合酶、和和的性质和功能的性质和功能性质DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶亚细胞定位细胞核细胞核线粒体基质细胞核细胞核引发酶活性有无无无无亚基数目41424催化亚基的大小（k）16018540125125210230或125140对dNTPs的Km值(M)251040.524内在的进行性中等低高低高在PCNA存在时的进行性中等低高高高3-
14、外切酶活性5-外切酶活性对3,5-ddNTP的敏感性低高高低中等对阿拉伯糖CTP的敏感性高低低高高对四环双萜的敏感性高低低高高生物功能细胞核DNA复制细胞核DNA修复线粒体DNA复制细胞核DNA复制核DNA复制和修复其他真核细胞其他真核细胞DNA聚合酶聚合酶 真核真核DNA聚合酶聚合酶和和在跨损伤合成中的作用在跨损伤合成中的作用 真核细胞真核细胞DNA聚合酶聚合酶由由PCNA三个亚基构成的滑动钳结构三个亚基构成的滑动钳结构 DNA解链酶解链酶 DNA解链酶是一类催化DNA双螺旋解链的酶。它几乎参与和DNA有关的一切代谢过程，包括DNA复制、转录、修复和重组。 任何一种DNA解链酶都能够结合DN
15、A，这种结合与DNA序列无关，这是解链酶作用的前提。大多数解链酶优先结合DNA的单链区域。 解链酶除了能够结合DNA以外，还能够结合NTP，并同时具有内在的依赖于DNA的NTP酶活性。 所有的DNA解链酶都具有移位酶活性。其移位酶活性使得它沿着被结合的DNA链单向移动，以不断地解开DNA双链区域。 大肠杆菌大肠杆菌DnaB蛋白的解链酶活性蛋白的解链酶活性 单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（SSB）是一种专门与DNA单链区域结合的蛋白质，为DNA复制、修复和重组的必需成分。SSB本身并没有任何酶的活性，但通过与DNA单链区段的结合在DNA复制、修复和重组中发挥以下几个方面的作用：（1）暂时维持D
16、NA的单链状态，防止互补的单链在作为复制模板之前重新退火成双螺旋；（2）防止DNA的单链区域自发形成链内二级结构，以消除它们对DNA聚合酶进行性的影响；（3）包被DNA的单链区段，防止核酸酶对DNA单链区域的水解；（4）刺激某些酶的活性。 大肠杆菌大肠杆菌SSB与单链与单链DNA结合的协同效应结合的协同效应 DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶是一类通过催化DNA链的断裂、旋转和重新连接而直接改变DNA拓扑学性质的酶。此类酶不仅可以解决在DNA复制、转录、重组和染色质重塑过程中遇到的拓扑学障碍，而且能够细调细胞内DNA的超螺旋程度，以促进DNA与蛋白质的相互作用，同时防止DNA形成有害的过度超螺旋。 按照DNA链的断裂方式，拓扑异构酶被分为I型和II型。I型在作用过程中，只能切开DNA的一条链，而II型均为寡聚体蛋白，在作用过程中同时交错切开DNA的两条链，并能在消耗ATP的同时将一个DNA双螺旋从一个位置经过另一个双螺旋的裂口“主动运输”到另外一个位置。 II型拓扑异构酶主要参与DNA复制，既可以在DNA分子中引入有利于复制的负超螺旋，又可以及时清除复制叉前进中形成的正超螺旋，还能
