猪链球菌2型抗体的检测酶联免疫吸附法.docx

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1、猪链球菌2型抗体的检测酶联免疫吸附法1范围本文件规定了猪链球菌2型抗体的酶联免疫吸附 法检测技术操作程序。本文件适用于猪链球菌2型抗体的检测和猪只接 种猪链球菌2型疫苗后的免疫效果评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成 本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用 文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文 件。兽医实验室生物安全技术管理规范(2003年10月 15日农业部第302号公告发布)。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3 1酶联免疫吸附试验 enzyme-1.inkedImmunosorbent A

2、ssay (E1.ISA)将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯 微量反应板)表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相 表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除。滴加 底物溶液后,底物可在酶作用下使其所含的供氢体由 无色的还原型变成有色的氧化型,出现颜色反应。可 通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应,颜 色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。 此种显色反应可通过E1.1.SA检测仪进行定量测定,从而 测定抗体或抗原含量。光密度 Optica1. Density (OD)测量被检测物吸收掉的光以及有多少光穿过了这 个物体。抗原 antigen是指能被免疫细胞识别,使免疫细胞活化发生免

3、 疫应答,并能在体内或体外与相应的免疫应答产物(抗 体或效应T细胞)发生特异性结合的物质。3 4抗体 antibody机体在抗原物质刺激下,由B细胞分化成的浆细胞 所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫 球蛋白。4原理在固相载体微孔板上预包被纯化的猪链球菌2型 特异性抗原,当被检血清中含有猪链球菌2型抗体时, 抗体与微孔壁上的抗原形成抗原-抗体复合物,再与羊 (兔)抗猪免疫球蛋白G (IgG)酶标记物反应,最后 通过测定酶作用底物催化后的产物颜色反应判断结果, 检测猪链球菌2型抗体水平。5试齐U- -预包被猪链球菌2型抗原的微孔板;- -血清稀释液;- -猪链球菌2型阳性对照血清;-

4、-猪链球菌2型阴性对照血清;- -羊(兔)抗猪免疫球蛋白G (IgG)酶(HRP)标 记二抗;- -显色液A;- -显色液B;终止液:硫酸(H2SO4)溶液(2mo1.1.);- -10 X浓缩洗涤液;- 样品稀释液;-商品化试剂盒:可选择同类的商品化试剂盒,比 如猪链球菌2型抗体检测试剂盒。6器材-微量移液器(量程10 u1.、100 1. 200 u1.、1000 1.);- -多道可调移液器(量程30300 1.);- -一次性移液器吸头;- -振荡器;- -酶标仪(含45Onn1.波长滤光片);- 37 恒温培养箱或水浴箱;- 100 m1.、1000 m1. 量筒;-离心机;-封板膜

5、;-一次性乳胶手套、口罩,护目镜;-吸水纸巾;-一次性采血器(最大量程5 m1.或IOnI1.)。7试验样品的准备71血液样品采集与处理采血方式为前腔静脉或耳静脉无菌采血。将生猪 绑定好后,用碘酊消毒采血部位,再用75%酒精棉球二 次消毒,最后用脱脂棉球拭干,使用5 m1.或IOnI1.一次 性采血器采集不少于2 m1.的非抗凝性全血。室温下倾 斜静置2h,待血液自然凝固后,放置2 8 冰箱 中不少于2 h, 4000 r/min离心IOmir1,使用 IOOO U 1. 量程的移液器小心吸出上层血清。7,血清样品保存与运输血清样品若在分离后一周内完成检测,可置于 2 8 条件下短期保存;若超

6、过一周后检测,应置 于-20 及以下冷冻保存。血清样品运输时,按照兽 医实验室生物安全技术管理规范(2003年10月15日 农业部第302号公告发布)进行样品的生物安全标识, 应用恒温箱加冰袋或干冰密封等方式冷藏运输,运输 时间应尽量缩短,确保血清样品有效。8操作方法将IOX浓缩洗涤液恢复至室温,摇匀,然后用蒸 储水或去离子水作10倍稀释,PH调至7.4。一样品稀释将已分离好的待检猪血清样品用样品稀释液做 1:10稀释,即取50 1.样品加到450 1.样品稀释液中, 并充分混匀。A1操作步骤8.3.1 酶标板上阴阳性对照和待检样品的分布(见表1)。 在A1.、BI加入阳性对照,100 1.孔

7、;CK D1.加入阴 性对照,IOO 1.孔;EK F1.加入空白对照,IOO 1./孔;GK H1.等其余孔加入稀释好的待检样品,100 1./孔。表1加样记录表(推荐模式)123456789101112APS3BPS4123456789101112CNS5DNS6EBS7FBS8GS1.S9HS2S1.O注:P一阳性对照孔N一阴性对照孔B一空白对照孔SK S2、S3等一待检样品孔,其余类推。8.3.2 用封板膜覆盖板条,置37 恒温箱或水浴箱中孵 育2h。8.3.3 弃净孔中液体,用力拍干,加入稀释好的洗涤液 300 1.孔,静置InIin后弃净、拍干,如此反复洗板3次。8.3.4 除空白

8、对照外,其余加入酶标记物50 1.孔,置37 孵育1 ho8.3.5 重复步骤8.3.3。8.3.6 3. 6重复步骤8. 3. 3o8.3.7 加入终止液50 1.孔,混匀后避光作用IOmin, 终止反应后20 min之内,用酶标仪在450 nm波长下测 定OD值。8.3.8 计算S/P值(被检血清0怯5。向值一阴性对照 0D450nm值)/(阳性对照0D450m值一阴性对照0D450nm值)。R 4试验成立条件阳性对照0D450 nm值大于0.6,且阴性对照OD45 nm值 小于0. 3,试验成立;否则,试验不成立,需重新试验。A弓结果判定8.5.1 如样品S/P值20. 60时,判为猪链

9、球菌2型抗体 阳性。8.5.2 如样品S/P值V0. 60时,判为猪链球菌2型抗体 阴性。8.5.3 若采用商品化试剂盒,应根据说明书进行操作及结果判定。9注意事项M所有操作应严格遵守兽医实验室生物安全规定;力用于加样的移液器应定期进行校准,以免产生误差 影响检测结果的准确性;Q,I 10倍浓缩洗涤液在低温保存时可能会产生白色结 晶,应加热使其溶解后再使用;9 4酶标记物溶液和终止液对呼吸道、眼睛及皮肤有刺 激作用,使用过程中应穿戴口罩、护目镜、手套等防 护用具,防止直接接触和吸入;一酶标记物溶液应避光保存,避免与氧化剂接触,盛 装底物溶液的容器应保持洁净;Q 6所有试剂均应按照要求进行保存,

10、使用前恢复至室 温;9 7血清稀释板的微孔只能使用一次。同步进行多板检测时,反应板不宜叠放在37 温箱中,宜将反应板平 放于湿盒内或覆盖封板膜后直接平放于温箱中,但不 宜采用密封袋,避免反应板受热不均。附录A(资料性)溶液的配制A. 1显色液A显色液A按下列配方进行配置:四甲基联苯胺(C6H22CI2N2):0.2 g;二甲基亚碉(DMSO) :8. 0 m1.;加蒸储水:定容至1 000 m1.;在800 m1.蒸储水中溶解上述各种成份,加蒸储水定容至1 Ooom1. 室温保存。A.2显色液B显色液B按下列配方进行配制:磷酸氢二钠(Na2HPO4) :14. 60 g;柠檬酸(C6H8O7,

11、分析纯):9. 33 g;0. 75%过氧化氢尿素(CH4N2O H2O2) :6. 4 m1.;加蒸储水:定容至1 000 m1.;在800 m1.蒸储水中溶解上述各种成份,用1 mo1./1.盐酸调节溶液PH 至5.0,加蒸储水定容至1 OOOm1.室温保存。A.3终止液将27. 8 m1.浓硫酸缓慢滴加入30OnI1.蒸储水中,边加边搅拌,补充 蒸储水至1 000 m1.。A. 4 IOX浓缩洗涤液IOX浓缩洗涤液按下列配方进行配制:氯化钠(NaC1.) :8.0g;磷酸二氢钾(KH2PO1) :0.2g;磷酸氢二钠(Na2HPO4 120) :2.9 g;氯化钾(KC1) :0.2g;

12、吐温-20 :5. 0 m1.;硫柳汞:0.1 g;蒸播水:定容至100 m1.;在80 m1.蒸储水中溶解上述各种成份,用1 mo1./1.盐酸调节溶液PH 至7.4,加蒸储水定容至IOOm1.。室温保存。A.5样品稀释液样品稀释液按下列配方进行配制:磷酸盐缓冲液(0.0InIoI/1. pH 8.0) :956.0 m1.;甘油:40. 0 m1.;酪蛋白:20. 0 g;硫柳汞钠:0.1 g;吐温-20:1.0 m1.;在956 m1.磷酸盐缓冲液中溶解上述其余成份。室温保存。A.6磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液按下列配方进行配制:氯化钠(NaC1.) :8.0 g;磷酸二氢钾(KH2PO4) :0.2 g;磷酸氢二钠(Na2HPO4 12H20) :2.9 g;氯化钾(KC1) :0.2 g;蒸播水:定容至1 000 m1.;在80Om1.蒸储水中溶解上述各种成份,调节溶液PH至&0,加蒸 储水定容至IoOOm1.室温保存。

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