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1、2023成骨细胞与破骨细胞间接共培养研究进展(全文)摘要在骨代谢过程中，成骨细胞形成新骨，破骨细胞吸收旧骨，一旦成骨细胞介导的骨基质形成和破骨细胞介导的骨吸收失衡，则会导致骨质疏松症等危害人类健康的疾病产生。因此，不同研究者致力于开发模拟体内环境的成骨细胞与破骨细胞体外共培养模型，以进行骨代谢相关疾病的研究。间接式共培养是通过物理方式将成骨细胞与破骨细胞分隔，使二者可以进行细胞间的交流而不接触，可以针对单一的细胞进行分析，在药物筛选及研究方面，具有高通量和经济便捷等独特的优势，本文对成骨细胞和破骨细胞的间接共培养技术进行归纳和总结。关键词成骨细胞；破骨细胞；间接共培养正文在骨组织代谢中,成骨细
2、胞(osteoblast,OB)介导的骨基质形成和破骨细胞(oste。ClaSt,OC)介导的骨吸收间的平衡是一个复杂的动态平衡过程。在骨基质被OC吸收的过程中，不同因子的释放，如鞘氨醇-1磷酸和骨形态发生蛋白6(BMP-6)等,可诱导OB沉积生成新骨山;在骨形成的过程中，OB分泌的细胞因子如核因子KB配体（RANKL）可以诱导OC的形成。在这一过程中任何一方的失调都可能造成骨组织的病理状态，如骨质疏松症、类风湿关节炎等2-4。由于机体内成骨细胞与破骨细胞间的相互影响，考察药物对单独成骨细胞或者破骨细胞的作用及机制，可能与机体内实际情况存在差异。因此,建立接近于体内环境的OB与OC共培养模型，
3、筛选防治骨相关疾病的潜在药物、考察其作用机制，是所有相关科研人员关注的焦点之一。在OB与OC共培养模型的研究中使用最早的是直接共培养模型,这个模型可以比较基础地反映OB与OC间的相互作用，但在进行细胞染色、RNA及蛋白等分析时，由于OB与OC处于混合状态，无法对单一细胞进行分析5-7。间接共培养模型可以实现两种细胞处于一个体系中，同时不同细胞又可分隔开,分别进行分析与检测8。相较于新兴起的3D培养，2D培养操作较为简便，可以在短时间内对较多的药物及化合物进行测试，检测评价方法常规，重现性好，较为经济快捷，利于骨相关疾病药物的筛选及研究9。因此，本文对2D成骨细胞与破骨细胞间接共培养模型进行归纳
4、和总结。1间接共培养模型的类别间接共培养模型大致可分为条件培养基模型10（图Ial玻片式共培养模型11（图Ib）及半透膜式共培养模型（图1c）3大类，其中半透膜式共培养模型又包括琼脂糖凝胶共培养模型12（图ICi）和Transwell/Boyden小室共培养模型13（图ICiil以现有报道来看，条件培养基模型、玻片式共培养模型以及琼脂糖凝胶共培养模型操作复杂,需要自制模型；相比之下zTranswellBoyden小室共培养模型操作简便，型号丰富，是间接共培养模型的主流选择。2细胞选择2.1 成骨细胞理论上来说，共培养所需要的OB应该来源于临床上相应骨病患者的OB,但病理状态下的OB一般增殖分化
5、能力较弱，难以满足实验的需要14,所以现有共培养模型大多采用诱导分化的方法得到0B。人源OB可以由人类骨髓间充质干细胞（hBMSCs）诱导分化得到，但其供体来源并不是每个实验室都可以轻易接触到，多见于临床研究报道15-16。目前，鼠源的成骨前体细胞得到了较为广泛的应用，包括从骨髓中分离得到的间充质干细胞（BMSCS）17-18、新生大小鼠的颅骨细胞等11/9-20。此外，成骨样细胞株或细胞系，如小鼠成骨细胞株MC3T3-E121-24x人成骨肉瘤细胞系Saos-213,15、原代人胎儿成骨细胞系hFOB1.1925等，细胞单一稳定，可以培养至较高的代数，也是国内外科学研究中使用较为普遍的。2.
6、2 破骨细胞OC是终末分化的多核细胞，来源于造血干细胞系的单核细胞，受多种因素的影响26。OC形成后，在体内存在时间极短，12d之后便会凋亡27。人源破骨细胞一般通过对人的血液样本进行分层提取，获得人的外周血单个核细胞(hPBMC),然后诱导得到10,28。对于动物破骨细胞的获得，通常取大鼠或者小鼠的股骨，对其骨髓进行分离，得到骨髓单核巨噬细胞(BMMS)并加以诱导最终得到多核融合的OC11,19-20。此外，小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞也可以诱导为OC,广泛使用于OC相关研究13,21-24,29。3间接共培养模型中细胞共培养方法3.1 细胞分化诱导由于成熟的OB和OC高度分化的特
7、性，大部分实验者选择成骨和破骨前体细胞进行共培养模型的构建，同时在培养基中添加相应的诱导物以促进OB和OC的分化生成。3.1.1 成骨细胞诱导培养液：0B诱导培养液一般由火甘油磷酸钠、维生素D3、地塞米松或抗坏血酸中的几种构成。现有报道中，OB诱导液的成分和浓度不完全固定，不同的诱导液所需的诱导时间亦有所变化。在MC3T3-E1细胞单独培养以及与4B12细胞的Transwell共培养模型中，添加10nmol/L-甘油磷酸和50gmL抗坏血酸进行诱导培养，15d后下室MC3T3-E1细胞形成矿化结节30。在MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞共培养模型中，添加10-8mol/L维生素D3诱
8、导17dMC3T3-E1细胞可分化为成熟的OB3103.1.2 破骨细胞诱导培养液：核因子KB受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)是诱导OC生成最为常见的成分。接种RAW264.7细胞的Transwell小室经50ng/mL的RANKL诱导3d后，移入铺有MC3T3-E1细胞的培养板中共培养7d抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色结果显示,RAW264.7细胞可被诱导分化为OC22.在hPBMC和hBMSC细胞共培养模型中，添力口IongmL的RANKL和M-SCF的诱导14d可以显著增加hPBMC对细胞外基质的再吸收量口5o3.2 细胞培养比例及相对位置正常人体内
9、OB与OC的比例大概为2：124o在已建立的的OB和OC共培养模型中,其比例大部分集中在1：22：1之间1。由于不同实验室侧重的研究方向、共培养方式以及培养基添加物不尽相同，因此，每个实验室应根据实际研究需要调整OB与OC的比例，以模拟正常或者特殊状态下的机体骨微环境。例如，模拟机体正常状态时，可以控制OB与OC比例为1：22：1;模拟机体特殊状态时，控制OB与OC细胞数量比例为1：10以模拟骨质疏松状态下的环境，或者使OB与OC细胞数量比例达到20：1以模拟骨生长恢复期的环境10,15,32。在接种细胞比例确定的情况下，要合理安排上下两室所种的细胞，便于后续检测。根据现有研究报道来看，有实验
10、者将OB接种于下室，共培养结束后可以进行茜素红染色检测其矿化能力；也有实验者将OC种于下室，以便于共培养结束后对下室OC细胞进行荧光染色，观察OC典型肌动蛋白环的生成15,28,30。3.3 培养时间成骨细胞前体在7d左右分化为前成骨细胞，此时前成骨细胞的相关标志物如碱性磷酸酶（ALP）等活性最高，之后会随着分化下降，为获得最佳OB相关标志物的检测结果，共培养的诱导时间选择在57d33-34o对于破骨细胞来讲,研究发现RAW264.7细胞在M-CSF和RANKL诱导第3天即可观察到OC的生成，此后随着诱导天数的增加，细胞凋亡加剧27,29。原代大鼠、小鼠骨髓单核巨噬细胞诱导510d形成成熟的O
11、C,在714dOC数量达到顶峰,而后开始逐渐减少进入衰退期29,35-37。因此，一般来讲诱导57d可以进行OC形态及其相关标志物的检测。如表1中所示，大部分文献中所记录的共培养时间集中在1周左右，其研究内容主要以OB的ALP检测和OC的TRAP染色为主;而检测茜素红矿化结节染色和骨吸收陷窝的共培养模型培养时间在14d及以上13,28。这是因为成骨前体细胞形成矿化时间大多集中在721d,同时骨吸收陷窝的出现相较于TRAP染色的最佳时间有滞后性，诱导培养时间大多集中在9d及以上35-36。OB与Oc分化、成熟以及功能执行需要一定的时间，两种细胞进行共培养时，需要根据研究侧重点的不同进行时间上的调
12、整。4讨论与展望OB与OC间接共培养已取得了初步进展。现有研究较多采用Transwell进行共培养模型的建立，共培养模型内的不同细胞可以分开进行分析考察。按照不同的研究目的,可以分为57d的共培养研究和921d的共培研究。57d的共培养研究侧重于未成熟的OB和成熟OC相关标志性因子的分析；9-21d的共培研究侧重于OB矿化以及OC骨吸收陷窝的检测。目前OB与OC间接共培养的应用范围包括口腔医学、骨科医学相关疾病的模型建立、药物筛选以及药理作用机制研究等。尽管共培养模型存在一些共性，但是由于细胞种类、培养时间、诱导物等变量过多，不同研究者的间接共培养模型是相对独立的，其模型对于OB和OC的生长、成熟、互作过程的研究侧重点不完全相同。相关研究者可以进一步联合探讨，得到相对通用、稳定和重复率高的间接共培养模型，为更好地探求骨吸收和骨形成间的串扰提供基础。（参考文献略）
