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1、2022复杂性肛瘦患者肠道微生态检测及分析（全文）摘要目的通过16SrDNA基因测序检测复杂性肛屡患者的肠道菌群分布，探讨其与健康人的菌群分布是否存在差异。方法采用病例对照研究方法，回顾性收集2020年6月至12月期间杭州市第三人民医院接受手术治疗的30例复杂性肛瘦患者临床资料（复杂性肛瘦组），并按1:1配比选择本院健康体检人群30例作为对照组（健康对照组）。病例纳入标准：（1）符合腺源性肛瘦诊断的标准，且症状持续3个月以上；（2）术前已行电子结肠镜检查排除肠道炎性反应、炎性肠病等；（3）复杂性肛瘦的定义为符合下面情况之一者：屡管跨越2/3及以上的肛门括约肌；包含两个以上的外口或瘦管；既往已行
2、肛屡手术后确认复发者。排除标准：（1）合并有炎性肠病、慢性腹泻或便秘、糖尿病、消化道恶性肿瘤、肝肾功能障碍等；（2）克罗恩病、外伤、特殊感染（如放线菌病和结核病）等引起的肛屡；（3）近1个月内使用过抗生素、益生元、益生菌等可能影响肠道微生态制剂者；（4）认知缺陷不能配合者。提取研究对象的粪便样本总DNA,扩增细菌16SrDNA基因序歹Il的V4高变区，利用IlluminaMiseq平台进行高通量测序，最后进行操作分类单元（OTU）聚类、进行Alpha多样性和LEfSE数据分析，其中Chao指数或ACE指数越大，表明微生物区系的预期物种丰度越高，Simpson指数越小或Shannon指数越大,表
3、明微生物区系多样性越高。两组间性别、年龄、体质指数(BMl)、饮酒吸烟史基线资料比较差异均无统计学意义(均40.05),说明两组具有可比性。本研究观察指标包括两组的测序和质量控制、Alpha多样性分析和物种及其丰度分析以及LEfSE分析。结果复杂性肛屡组与健康对照组的主要优势菌都是厚壁菌门和拟杆菌门，分别占93.4%32.0%和87.4%41.2%;在属水平上，复杂性肛瘦组的普雷沃菌属(4.9%7.4%比0.1%l.l%,P0.001)、巨细胞菌属(3.9%8.2%比0.5%4.2%lP0.05海口毛螺菌属(2.6%5.7%比0.1%3.4%,A0.05)的丰度明显更高,而变形菌属(0.02%
4、4.2%比9.3%14.4%lP0.01)、肠球菌属(0.02%2.3%9.3%19.6%fP0.05)、拟杆菌属(24.7%9.9%比29.8%9.1%,P0.05)和克雷伯菌属(0.4%4.2%kb3.9%7.3%,P0.05)相对更低。与健康对照组相比，复杂性肛屡组肠道菌群多样性更丰富，表现为ACE指数更高(293.3044.00)比(218.7533.83),102.069,P4)o结论与健康对照组相比，复杂性肛瘦患者肠道菌群多样性更丰富，提示某些肠道菌群及其代谢产物可能在肛屡发病中发挥了一定的作用。肛瘦是肛肠外科的常见病和多发病，好发于青壮年，典型的临床表现为肛门疼痛和流脓，严重影响
5、患者的工作和生活。但是复杂性肛瘦术后容易复发，还存在肛门括约肌损伤的风险，这一直是肛肠外科医生面临的一大挑战。所以，进一步理解肛屡的发病机制对于提高肛屡的治疗效果很有必要。目前，公认关于肛屡发病机制的理论是Parks和EiSenhammer提出的隐窝感染学说2-4。但是该学说并不能有效阐明为什么同样含有大量致病菌的健康人群没有发生肛屡。近年研究表明，肠道菌群的动态平衡与人体健康密不可分，一旦发生紊乱会引发多种疾病。肛屡患者，特别是复杂性肛瘦患者是否存在有异于健康人群的肠道微生态，才导致肛瘦的发生呢？目前这方面的研究尚未见报道，为了验证这一假说，我们利用高通量测序技术，检测并分析了复杂性肛瘦患者
6、与健康人群肠道菌群的多样性差异，以期为后续研究提供基础。一、资料与方法一研究对象采用病例对照研究方法。(-)病例组纳入标准和排除标准纳入标准：(1)符合腺源性肛屡诊断的标准囚，且症状持续3个月以上；(2)复杂性肛屡的定义为符合下面情况之一者：瘦管跨越2/3及以上的肛门括约肌；包含两个以上的外口或瘦管；既往已行肛屡手术后确认复发者。排除标准：（1）合并有炎性肠病、慢性腹泻或便秘、糖尿病、消化道恶性肿瘤、肝肾功能障碍等；（2）克罗恩病、外伤、特殊感染（如放线菌病和结核病）等引起的肛屡；（3）近1个月内使用过抗生素、益生元、益生菌等可能影响肠道微生态制剂者；（4）认知缺陷不能配合者。根据上述标准，回
7、顾性收集杭州市第三人民医院2020年6-12月期间接受手术治疗的30例复杂性肛屡患者临床资料，设为病例组（复杂性肛屡组）。（二）对照组选择方法以1：1配比选取本院健康体检的人群30例作为对照组（健康对照组），配比条件包括年龄、性别、体质指数（bodymassindex,BMI）等。两组间性别、年龄、BMI、饮酒吸烟史基线资料比较差异均无统计学意义（均Q005）,见表L本研究经医院伦理委员会审批通过（审批号：Y-KL2020015）,所有受试者均知情并签署标本采集同意书。表1匏杂性肛矮组Lj健康时照组临东基线资料比较炮别例数性别问（%）;年龄（岁体欣指数(km2.)饮酒史（%）吸烟史（%）W女纪
8、杂件业婚组3012(40.0)18(60.0)33.4814.6422.38x1.9614(46.7)9(30.0)fifLftXiWffl3014(46.7)16(53.3)30.64ll.762l.492.5313(43.3)!0(33.3)统计他Xw)切/=0.738/=0.5752=0.0671=0.077p(fi0.6020.4700.6600.7950.781二.粪便样本收集与保存嘱受试者收集新鲜清洁粪便约2g置于粪便采样盒内，注意收集粪便时应避免收集尿液污染和固体残渣部分，女性受试者收集粪便应在月经干净45d后，避免血液污染粪便。收集到的粪便样本在30min内放置于超低温冰箱（-
9、80）内保存备用。=.粪便细菌DNA的提取.扩增和纯化取大约50mg粪便样品按照粪便微生物DNA提取试剂盒MinkaGeneStoolDNAkit）说明书的要求提取每个粪便样品中的总微生物DNAo选取微生物16SrDNA基因的V4可变区进行扩增。正向引物为514F-5GTGCCAGCMGCCGCGGTAA3,反向弓I物为1063R-5fACAGCCATGCANCACCT3,扩增反应选择20lPCR反应体系。接着用含演化乙锭的2%的琼脂糖凝胶回收所得到的PCR产物，将所得到的PCR产物进行纯化（利用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切割凝胶），用Tris-HCI洗脱纯化后的PCR产物，并在150
10、V下电泳30min,分析提取基因组DNA的质量。四、肠道菌群高通量测序依据IlluminaMiseq平台的操作流程进行文库构建，并委托博奥生物科技有限公司完成肠道菌群DNA16SrRNA高通量测序。去除重叠长度10bp或者错配率0.2的不合格序列。五.生物信息学分析1.操作分类单元（OPerationaltaxonomicunit,OTU）聚类:OTU的提出目标是指定一个定量策略，不同的16SrRNA序列同源性97%就可以定义为一个OTU,每个OTU对应于一个不同的16SrRNA序列，也就是每个OTU对应一个不同的细菌（微生物）种。通过OTU分析来判断样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度。2
11、Alpha多样性分析：Alpha多样性分析中的主要指标包括Chao指数、ACE指数、Simpson指数、Shannon指数等。通过这些指标的计算分析，可了解单样本中微生物的丰度以及多样性。ACE和Chao指数反映样本中OTU的丰度,shannon和Simpson指数反映样本中OTU的多样性。ACE或Chao指数越大，表明微生物区系的预期物种丰度越高,Simpson指数越小或ShannOn指数越大，表明微生物区系的多样性越高。3.LEfSE分析：主要是实现多个分组及其亚组之间比较，从而找到组间在丰度上有显著差异的物种。本研究中，LDA值绝对值4设定为丰度上有显著差异。六、统计学方法采用SPSS1
12、9.0统计软件对数据进行分析整理。对呈正态分布且方差齐性的计量资料使用xs表示，组间比较采用配对检验。计数资料用百分数表示，组间比较采用配对2检验。P0.05时差异有统计学意义。二、结果一.测序和质量控制对60例粪便样本微生物基因组进行高通量测序，共计收集848775条序列，其中复杂性肛屡组和健康对照组的总序列分别为363900条和484875条。去除所有不合格的序列后，复杂性肛瘦组和健康对照组最终获得的有效序列分别为(454973938)条和(484781641)条，两组比较差异无统计学意义(0.724,P=0.462)。序列分析结果显示，两组共测得675个OTU,组间OTU相似度达到97%
13、,其中复杂性肛瘦组有603个OTU,健康对照组579个OTU;两组共有的OTU数为507个，复杂性肛屡组与健康对照组特有的OTU数分别为96个和72个。二.AIPha多样性分析Alpha多样性分析结果显示：复杂性肛屡组患者肠道菌群的ACE指数、Chao指数和Shannon指数均高于健康对照组，而在Simpson指数低于健康对照组，差异均具有统计学意义（均A0.05）。见表2。表明复杂性肛屡组患者肠道菌群的多样性更为丰富。表2复杂性肌搂组与健康对照组肠道菌群AIpha多样性比较组别例数AcE指数Chao指数Shannon指数SilnPMOn指数纪杂性H强组30293.3044.003l8.40t
14、4l.993.361O.29O.1O31O.OI3健康对照组30218.7533.83250.00146.382.43O,34O.BIO.OI3，值102.06977.8189.6575.551O.OS）复杂性肛瘦组和健康对照组共同的优势菌为厚壁菌门和拟杆菌门，分别占总门数的93.4%32.0%和87.4%41.2%见表2。2 .属水平方面的比较：在属水平上，与健康对照组相比，复杂性肛瘦组中普雷沃菌属巨单胞菌属和毛螺菌属的丰度更高，差异均有统计学意义（均Z70.05);复杂街工瘦组变形菌属、肠球菌属、拟杆菌属和克雷伯菌属则要低于健康对照组，差异均有统计学意义(均Q0.05)。四、LEfSE分析两组微生物组相对丰度的LEfSE分析结果显示，复杂性肛屡组中韦荣菌科(Veillonellaceae)(LDA值=4.896)、Selenomonadales(LDA值=4.637)和厌氧菌纲(Negat
