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1、雌激素受体、孕激素受体抗体试剂及检测试剂盒技术审查指导原则本指导原则旨在指导注册申请人对雌激素受体、孕激素受体抗体试剂及检测试剂盒注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。本指导原则是对雌激素受体、孕激素受体抗体试剂及检测试剂盒的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，不涉及注册审批所等行政事项，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着
2、法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。一、范围雌激素受体(EstrogenReceptor,ER)和孕激素受体(ProgesteroneReceptor,PR)是调节生殖系统及乳腺等器官细胞生长发育的重要分子，也是乳腺癌的重要生物标记物。ER和PR的表达情况与患者的内分泌治疗效果相关。目前，ER、PR检测广泛应用于乳腺癌患者的预后判断与指导用药。ER有两种亚型,分别是ERa和ER,两者结构相似，但在组织分布及生物学功能上不尽相同。其中ER于1996年首次发现，远晚于ER,目前对于ERB在组织中表达情况及调控作用尚不清晰。本指南所提及ER为ERao对ER和
3、PR的准确检测，是乳腺癌患者接受恰当治疗的重要依据。我国相关乳腺癌诊治指南已将ER、PR的免疫组织化学检测列为乳腺癌患者的常规检测项目，并用于指导患者的内分泌治疗。但目前ER、PR检测在不同临床检测机构之间、不同检测试剂之间存在测定结果差异。检测结果中存在一定比例的假阳性和假阴性结果。相关生产企业必须充分意识到该类产品的潜在风险，根据本指导原则的要求，对该类试剂的安全性和有效性进行科学合理的验证。雌激素受体、孕激素受体抗体试剂及检测试剂盒是指利用免疫组织化学法，对病理组织切片中雌激素受体或孕激素受体进行检测的试剂。此类试剂为特异性单克隆或多克隆抗体，或抗体与显色系统、对照试剂、质控片（如有）及
4、其它辅助试剂一同包装成试剂盒形式的检测试剂，用于乳腺癌患者的预后判断、指导用药及对其它肿瘤的鉴别诊断。本指导原则仅包括雌激素受体、孕激素受体抗体试剂及检测试剂盒注册申报资料中部分项目的要求，适用于进行产品注册和相关许可事项变更的产品。其他未尽事宜（包括产品风险分析资料等），应当符合体外诊断试剂注册管理办法（国家食品药品监督管理总局令第5号）（以下简称办法）等相关法规要求。二、注册申报资料要求（一）综述资料内容应符合办法和关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的相关要求，并建议申请人着重介绍以下几方面内容：1.生物学特性，包
5、括受体的基本结构和信号转导途径；2 .组织分布与功能；3 .与疾病和治疗的关系；4 .国际和国内同类产品异同介绍，包括第一抗体克隆的选择、显色系统选择、试验方法和样本处理等。（二）主要原材料研究资料1 .以文献的形式阐述ER/PR检测的临床意义。2 .第一抗体的详细研究资料。2.1 详细的抗体性质鉴定资料，包括：抗体的特异性、亲和常数及效价、抗体的类型及亚型、抗体蛋白纯度的验证。对于企业自制抗体，还应提供抗体识别位点的验证。申请人可通过放射性免疫分析法、双向琼脂扩散法、酶联免疫吸附法、免疫印迹法、凝胶电泳等方法进行研究。2.2 第一抗体的克隆选择、制备、纯化等详细试验资料,包括以下两种情况:企
6、业自制抗体详述抗体克隆的选择依据，可提交文献资料或克隆选择的试验研究资料；明确免疫源和抗原的性质。企业外购抗体详述抗体克隆的选择依据，可提交文献资料或克隆选择的试验研究资料（建议企业选择已经临床充分验证的克隆作为第一抗体）；明确免疫源、抗原的性质及外购方名称；提交外购方出具的抗体性能指标及检验证书，详述申请人对该抗体技术指标的要求和申请人确定该抗体作为主要原材料的依据。3 .酶标第二抗体系统（如适用）的选择及验证资料。检测试剂盒中的第二抗体系统一般均为外购，应详述酶标第二抗体系统的确定依据，明确外购方名称，提交外购方出具的检验证书，详述申请人对酶标第二抗体系统相关主要原材料的技术指标。4 .企
7、业内部质控片及试剂盒配套质控片（如适用）的研究资料。详述内部质控片的组成，包括组织类型、例数和强度。应提供对内部质控片组织类型和强度的确定依据，建议采用临床上普遍认为质量较好的同类试剂进行确认。建议在试剂盒中设置弱阳性质控品（如适用），以便更加灵敏的监控试验过程中可能出现的错误结果。5 .封闭液的研究资料。封闭液应能够封闭非特异结合、内源性酶活性或内源性生物素等。6 .其他主要原辅料的选择及验证资料，如牛血清白蛋白、抗原修复液、抗菌剂等。该类主要原辅料一般均为外购，应说明有生物活性的原辅料的外购方名称，提交外购方出具的检验证书，详述申请人对每一原辅料的质量要求。（三）主要生产工艺及反应体系的研
8、究资料1.主要生产工艺介绍，可用流程图方式表示，并简要说明主要生产工艺的确定依据。7 .第一抗体制备的详细研究资料（如适用）。8 .产品基本反应原理介绍。9 .详述抗原修复方法的确定依据。10 .最适抗体滴度和抗体孵育时间确定的研究。11 检测体系反应条件确定的研究：申请人应考虑脱蜡水化、酶阻断、抗体孵育、显色、复染等各个步骤对产品性能的影响，通过试验确定上述条件的最佳组合。常规免疫组织化学检测步骤的确定，可引用行业和企业内部规范性操作手册或文献，但应对确定后的检测步骤进行性能验证。（四）分析性能评估资料申请人应提交在产品研制或成品验证阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法
9、、质控标准、试验数据、统计分析等详细资料。对于本类产品建议着重对以下分析性能进行研究：1.免疫反应性1.1 正常组织：对30种正常人体组织（见表1）,每种组织类型不少于3例，进行特异性评价，同时对着色位置及染色特点进行描述。表1：正常组织列表中枢神经系统脑、大脑（灰质与白质神经元、胶质等）脑、小脑内分泌系统肾上腺（皮质与髓质）卵巢胰腺（胰岛与外分泌胰腺）甲状旁腺垂体（腺垂体与神经垂体）睾丸甲状腺（滤泡上皮、滤泡旁细胞、胶体等）乳腺乳腺（乳腺小叶、乳腺管、肌上皮细胞等）造血组织脾扁桃体胸腺（幼儿）骨髓（淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、粒细胞、红系祖细胞、巨核细胞、肥大细胞、破骨细胞、成骨细胞）呼吸
10、系统肺（支气管、细支气管、肺泡等）心血管心脏消化系统食管胃小肠（回肠、空肠或十二指肠）结直肠肝脏（门静脉、肝细胞等）唾液腺肾泌尿生殖系统前列腺子宫（宫体、宫颈）膀胱骨骼肌肉骨骼肌皮肤皮肤（表皮、附件、真皮）外周神经系统外周神经间皮细胞胸壁、腹壁、心包膜或胃肠、心脏与/或肺样本表面内层细胞1.2 非正常组织：对相关良性、恶性病变组织（见表2）进行特异性评价，每种组织类型不少于3例。如有采用申报产品为试验材料进行研究的相关文献资料，也可提交文献资料验证抗体试剂或检测试剂盒与非正常组织的免疫反应性。表2：非正常组织列表乳腺导管癌黑色素瘤一淋巴瘤-胰岛素瘤一卵巢癌子宫颈鳞状细胞癌胃腺癌肺鳞癌肺腺癌一结
11、直肠腺癌一食管鳞癌肝细胞肝癌一胰腺导管癌肾透明细胞子宫内膜癌一前列腺癌一乳腺纤维腺瘤前列腺增生症膀胱癌1.3 ER抗体试剂或ER检测试剂应对ER的交叉反应进行评价。可利用ERa和ER的分子量差异，采用免疫印记法或利用免疫组织化学方法对ER高表达、ERa不表达的组织样本进行免疫反应性研究，验证抗体的特异性。也可利用其它合理的方法进行交叉反应研究。1.4 可选择经充分验证的组织芯片或经10%中性缓冲福尔马林固定石蜡包埋的组织切片进行免疫反应性研究。应明确样本组织类型的确定方法，应提供商业化组织芯片相关信息。2 .精密度2.1 检测内精密度：对连续切片的乳腺癌样本，进行检测重复性研究。包括染色强度、
12、阳性细胞百分比及着色位置。2.2 检测间精密度：对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，包括批次（不少于3批次）、适用机型、操作方法（手工/自动）、检测时间和操作人员。2.3 建议对不同染色强度、不同阳性细胞百分比及ER/PR阴性的乳腺癌样本进行包含染色位置，染色强度和阳性细胞百分比数的精密度研究。3 .灵敏度建议申请人对不少于5例ER/PR弱阳性样本（l%-10%）进行灵敏度评价。4 .参加国内外质控机构的质控活动情况建议企业积极参加国内（卫生计生委病理质控评价中心）、国际质控机构（NordiQC、UKNEQUAS、CAP等）的质控活动,并提交质控结果报告。（五）阳性判断值资料提交最新的国际
13、、国内诊疗指南等相关文献资料。提交染色特点的研究资料，包括阳性样本着色颜色、染色部位、背景信息及不同强度阳性组织的染色特点。（六）稳定性研究资料稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。前者应至少包括实时稳定性、运输稳定性、开瓶稳定性、机载稳定性（如适用）和稀释稳定性（如适用）研究。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少3批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。样本稳定性研究至少包括切片在不同储存条件下的稳定性研究。试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果应分别在说明书【储存条
14、件及有效期】和【样本要求】项中进行详细说明。（七）临床试验1 .试验方法选择已批准上市，临床普遍认为质量较好，如该抗体克隆经过国际权威机构（如NordiQC等）年度评分成绩较好的同品种产品，作为对比试剂。采用试验用体外诊断试剂与之进行比较研究，证明本品与已上市产品等效。计算所有检测乳腺癌样本中ER或PR阳性比例，间接验证ER及PR的检测有效性。对于第一抗体选择未经充分临床验证克隆的PR检测试剂，还应对不少于200例乳腺癌样本同时进行ER、PR检测，分别计算阳性比例并对出现的ERG)PR(+)样本，用其他合理的方法进行复核并分析原因。对于预期用途中已明确配合具体治疗药物名称的ER、PR检测试剂，
15、应采用联合药物评价临床试验的形式，同时评价检测结果与接受治疗后临床预后的相关性和试验用体外诊断试剂与对比试剂检测的一致性。2 .临床试验机构的选择申请人应选定不少于3家(含3家)临床试验机构开展临床试验。临床试验机构应获得国家食品药品监督管理总局资质认可。尽量使各临床试验机构的临床样本有一定的区域代表性。临床试验机构应具有严格的质量管理体系，执行实验室内部日常质量控制，参加国家病理以及国际病理质控机构的质控活动。3 .临床试验方案3.1 各临床试验机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床试验机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉试验进程，尤其是数据收集过程。3.2 以图表的形式对试验总体设计及工作流程进行描述。图表中应包括连续切片的数量及用途分配等。3.3 试验方案中应确定严格的病例纳入/排除选择标准，任何已经入选的病例再被排除出临床试验都应记录在案，并明确说明原因。各临床试验机构选用的对比试剂应保持一致，以便进行合理的统计学分析。3.4 试验
