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1、基因工程基因工程 Genetic EngineeringGenetic Engineering第三章第三章 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程Escherichia coli（SEM，14000）四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化三、工程菌构建策略三、工程菌构建策略二、大肠杆菌表达系统高效表达原理二、大肠杆菌表达系统高效表达原理一、一、大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例第三章第三章 大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程n工程菌构建工程菌构建n发酵工艺研究
2、发酵工艺研究n分离纯化工艺研究分离纯化工艺研究四、工程菌构建、发酵与产物分离纯化四、工程菌构建、发酵与产物分离纯化 工程菌构建研究内容与技术路线工程菌构建研究内容与技术路线目的蛋白分析目的蛋白分析表达载体与宿主表达载体与宿主菌株选择菌株选择目的基因的获得目的基因的获得与优化与优化表达载体构建与分析表达载体构建与分析转化与表达筛选转化与表达筛选工程菌稳定性分析工程菌稳定性分析表达产物确证表达产物确证工程菌菌种保存工程菌菌种保存1 1、目的蛋白分析：、目的蛋白分析：糖基化？难表达？难复性？药用？糖基化？难表达？难复性？药用？1)1)理化特性理化特性(www.expasy.org)(www.expa
3、sy.org)*分子大小：分子大小：5KD、100KD难表达难表达（融合表达、截短表（融合表达、截短表达）达）*氨基酸组成：氨基酸组成：Cys、Pro多的难表达多的难表达（用真核系统）（用真核系统）*疏水性：疏水性强的难表达疏水性：疏水性强的难表达（截短表达、用真核系统）（截短表达、用真核系统）2)2)生物学特性：生物学特性：膜蛋白难表达膜蛋白难表达（截短表达、用真核系统）截短表达、用真核系统）工程菌构建主要研究内容工程菌构建主要研究内容3)3)用途用途药用：安全性、产量、成本药用：安全性、产量、成本（包涵体、独立表达）（包涵体、独立表达）工业用：产量、成本工业用：产量、成本（包涵体、独立表达
4、）（包涵体、独立表达）研究用：迅速获得活性产品为首要考虑研究用：迅速获得活性产品为首要考虑（可溶、融合表达）（可溶、融合表达）工程菌构建主要研究内容工程菌构建主要研究内容2 2、选择表达载体与宿主菌株：、选择表达载体与宿主菌株：1 1）表达载体选择）表达载体选择 启动子、标签、标记基因、拷贝数等。启动子、标签、标记基因、拷贝数等。需要可溶表达时采用弱启动子，需要可溶表达时采用弱启动子，T7T7启动子最强，启动子最强，PL/PRPL/PR热激诱导不宜工业化。热激诱导不宜工业化。从蛋白特性、用途、发酵和分离纯化工艺考虑标签。从蛋白特性、用途、发酵和分离纯化工艺考虑标签。药用避免氨苄青霉素，用卡拉霉
5、素。药用避免氨苄青霉素，用卡拉霉素。4 4）宿主菌：）宿主菌：符合符合表达要求（表达要求（T7 RNAT7 RNA酶溶源？可溶？稀有酶溶源？可溶？稀有密码密码tRNAtRNA？），来源与遗传背景清楚，资料翔实。？），来源与遗传背景清楚，资料翔实。工程菌构建主要研究内容工程菌构建主要研究内容3 3、目的基因获得、分析与优化、目的基因获得、分析与优化 克隆、合成、索要？克隆、合成、索要？工程菌构建主要研究内容工程菌构建主要研究内容n 翻译起始位点与终止密码子：头尾不要缺，中间不能断翻译起始位点与终止密码子：头尾不要缺，中间不能断nGC含量：含量：70%时表达水平低时表达水平低n二级结构二级结构：m
6、RNA 二级结构抑制翻译的起始或终止。二级结构抑制翻译的起始或终止。n基因或者蛋白的大小：一般说来小于基因或者蛋白的大小：一般说来小于 5kD 或者大于或者大于 100kD 的蛋白都是难以表达的。前者融合表达，后者截取的蛋白都是难以表达的。前者融合表达，后者截取表达（如抗原用途，选抗原性强、好表达区段）。表达（如抗原用途，选抗原性强、好表达区段）。n疏水性：疏水性强的、特别是膜蛋白难表达。截取表达。疏水性：疏水性强的、特别是膜蛋白难表达。截取表达。nN端和端和C端稳定性端稳定性：人为突变末端残基。：人为突变末端残基。4 4、表达载体构建与分析、表达载体构建与分析1 1）根据选定载体物理图和基因
7、特点设计与构建）根据选定载体物理图和基因特点设计与构建 PCRPCR扩增目的基因：扩增目的基因：*引物中引入适当的酶切位点，避免基因内部位点。引物中引入适当的酶切位点，避免基因内部位点。*是否需要目的基因带入是否需要目的基因带入ATGATG和和TAATAA？是否要对框？是否要对框？2 2）表达载体酶切分析：双酶切、多酶切图谱分析）表达载体酶切分析：双酶切、多酶切图谱分析3 3）目的基因序列分析：目的基因或表达盒序列分析）目的基因序列分析：目的基因或表达盒序列分析 工程菌构建主要研究内容工程菌构建主要研究内容 pET21a质粒物理图谱质粒物理图谱pET21a质粒多克隆位点与表达盒质粒多克隆位点与
8、表达盒 pET32a质粒物理图谱质粒物理图谱pET32a质粒多克隆位点与表达盒质粒多克隆位点与表达盒 M 1 2 3 4 目的基因：目的基因：VL-,表达载体：表达载体：pET32aM：Maker，1kb lader1：PCR产物，引物含NcoI、HindIII 2：HindIII单酶切pET32a质粒3：NcoI-HindIII双酶切重组子4：HindIII单酶切重组子pET32a-VL-酶切鉴定酶切鉴定 5 5、转化与表达筛选、转化与表达筛选 1 1）转化选定的工程菌宿主株（不同于克隆）转化选定的工程菌宿主株（不同于克隆宿主菌！）宿主菌！）2 2）表达筛选：表达筛选：以表达水平（以表达水平
9、（%）为指标。）为指标。表达水平（表达水平（%）=目的产物占总蛋白的百目的产物占总蛋白的百 分数分数 测定方法：测定方法：SDS-PAGE+SDS-PAGE+凝胶扫描分析凝胶扫描分析 工程菌构建主要研究内容工程菌构建主要研究内容6 6、表达产物确证、表达产物确证 1 1）基本要求：）基本要求：SDS-PAGE+Western-BlotSDS-PAGE+Western-Blot 2 2）特殊要求（如基因工程药物）：）特殊要求（如基因工程药物）：A A、结构：、结构：末端顺序（末端顺序（N-N-端端1515个个/C/C端端3 3个）、氨基个）、氨基 酸组成、肽图等酸组成、肽图等 B B、理化特性：
10、、理化特性：分子量（分子量（SDS-PAGESDS-PAGE、质谱）、等电点、质谱）、等电点、紫外特征吸收峰等紫外特征吸收峰等 C C、生物学活性、生物学活性 工程菌构建主要内容工程菌构建主要内容基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制改善工程菌不稳定性的策略 大肠杆菌工程菌的不稳定性大肠杆菌工程菌的不稳定性工程菌遗传稳定性分析 7、工程菌遗传稳定性分析、工程菌遗传稳定性分析工程菌遗传不稳定性的表现形式工程菌遗传不稳定性的表现形式结构不稳定性结构不稳定性重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失（不表达、产物结构改变）分配不稳定性（主要）分配不稳定性（主要）整个重组DN
11、A分子从受体细胞中逃逸（curing）。导致表达水平下降。重组质粒的逃逸：工程菌部分细胞因质粒丢失而不再携带重组质粒的现象。重组质粒的宏观逃逸率：工程菌培养液中丢失质粒的细胞占细胞总数的百分比。宏观逃逸率（%）=非选择性非选择性平板菌落数平板菌落数-选择性选择性平板菌落数平板菌落数非选择性非选择性平板菌落数平板菌落数100关闭质粒DNA合成途径，启动降解程序重组质粒逃逸的原因环境因素诱导的重组质粒渗漏高温、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料（吖啶）目的基因高效表达诱导宿主细胞产生应激反应目的基因表达盒“转录过头”，影响Ori区域。目的基因本底表达产物引起的毒性反应抗性标记基因过表达，抗
12、生素消耗过快。重组质粒结构不稳定性的产生原因重组质粒结构不稳定性的产生原因宿主细胞中的修饰性酶系对外源重组DNA分子的破坏环境因素诱导的突变宿主细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排改善基因工程菌不稳定性的策略1 1、改进载体、改进载体-宿主系统宿主系统选择性地杀死无质粒细胞如敲除宿主基因组致死性基因（如ssb基因，缺失无法DNA复制），并将其改由表达载体提供正确设置载体上的多克隆位点，避免DNA片段插在稳定区内选择特定质粒最适宿主菌株使用可控型复制子（扩增与表达诱导同步使用可控型复制子（扩增与表达诱导同步)改善基因工程菌不稳定性的策略2 2、施加选择压力、施加选择压力根据载体上的抗药性
13、标记，向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时不宜使用抗生素采用营养缺陷型宿主菌，载体含营养标记，培养基不含该营养组份改善基因工程菌不稳定性的策略3、采用严紧调控型载体系统，减少本底表达造成的不稳定、采用严紧调控型载体系统，减少本底表达造成的不稳定4、优化工程菌的培养工艺、优化工程菌的培养工艺培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定 在非选择条件下连续传代数代后，对工程菌重组质粒在非选择条件下连续传代数代后，对工程菌重组质粒存在状况、结构完整性和功能完整性进行分析：存在状况、结构完整性和功能完整性进行分析：A A、存在状况：、存在状况：宏观
14、逃逸率宏观逃逸率 B B、结构完整性：、结构完整性：酶切图谱分析、序列分析酶切图谱分析、序列分析 C C、功能完整性：、功能完整性：表达产物免疫特异性（表达产物免疫特异性（western blotting)western blotting)表达水平（表达水平（%）工程菌遗传稳定性分析工程菌遗传稳定性分析1 1、原始菌种保存：、原始菌种保存：实验室构建而来。冻干、实验室构建而来。冻干、-70-70保存保存。表达载体（质粒表达载体（质粒）和宿主菌分别冻存更稳定。）和宿主菌分别冻存更稳定。2 2、主细胞库（、主细胞库（master cell bank,MCBmaster cell bank,MCB）
15、：）：由原始菌种单一克隆一次培养与分装而来，供工作细胞由原始菌种单一克隆一次培养与分装而来，供工作细胞库制备。库制备。冻干、冻干、-70-70保存保存。3、工作细胞库（、工作细胞库（working cell bank,WCB）:由主细胞库单个最小包装甘油种培养与分装而来，供生由主细胞库单个最小包装甘油种培养与分装而来，供生产用。产用。甘油种，甘油种，-70-70保存。保存。8、工程菌菌种保存（三级种子库）工程菌菌种保存（三级种子库）工程菌生长与表达主要影响因素工程菌生长与表达主要影响因素 工程菌摇瓶水平生长与表达试验工程菌摇瓶水平生长与表达试验 工程菌工业发酵工艺研究工程菌工业发酵工艺研究工程
16、菌发酵工艺研究工程菌发酵工艺研究1 1、培养基、培养基2 2、菌龄与接种量、菌龄与接种量3 3、pHpH值、温度与溶解氧值、温度与溶解氧4 4、诱导时机与收菌时机、诱导时机与收菌时机工程菌生长与表达主要影响因素工程菌生长与表达主要影响因素工程菌生长曲线与表达曲线分析工程菌生长曲线与表达曲线分析生长曲线生长曲线 纵坐标：生物量（细胞密度纵坐标：生物量（细胞密度OD600OD600、干重、干重/体积、湿重体积、湿重/体积）体积）横坐标：培养时间（小时）横坐标：培养时间（小时）时期：停滞期、加速期、对数期、减速期、平台期、衰减期时期：停滞期、加速期、对数期、减速期、平台期、衰减期表达曲线表达曲线 纵坐标：表达水平（纵坐标：表达水平（%）、活性单位）、活性单位/体积体积 横坐标：培养时间（小时）横坐标：培养时间（小时）1 1、培养基、培养基 影响菌体生长、质粒稳定性、表达水平、产物可溶性等影响菌体生长、质粒稳定性、表达水平、产物可溶性等 碳源碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等 应避免外源基因表达的应避免外源基因表达的“葡萄糖效应葡萄糖效应”。氮源氮源：
