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1、凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质分离纯化及鉴定蛋白质分离纯化及鉴定凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法1.试验原理试验原理 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。据被分离物质的分子大小不同来进行分离。凝胶层析的原理Kd=(Ve-Vo)/Vi优点优点a.条件温和 b.操作简便 c.损失少回收率高d.层析柱可反复使用2.凝胶及凝胶柱的选择凝胶及凝胶柱的选择根据不同分子量选择不同凝胶a.Sephadex:交联葡聚糖交联葡聚糖 G-10，15，25，50，75，100，150，200；得水值；得水
2、值 X 10b.Sepharose：琼脂糖凝胶：琼脂糖凝胶 Bio-Gel Ac.Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛：聚丙烯酰胺凝胶分子筛d.Sephacryl：用：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶的葡聚糖凝胶凝胶柱的选择凝胶柱的选择3.凝胶的前处理凝胶的前处理a.溶胀：溶胀：称取适量凝胶干粉，用约称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水倍蒸馏水浸泡浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。上层悬浮物及蒸馏水。b.碱洗：碱洗：用用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。后用蒸馏
3、水洗至中性。c.酸洗：酸洗：用用0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时，然后溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。用蒸馏水洗至中性。d.平衡：平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同。与起始缓冲液相同。a.将层析柱垂直固定，加入适将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。量溶剂排走空气。b.将平衡好的凝胶搅匀，连续将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至倾入柱中，待其自然沉降至1/41/3高时打开下端出口，高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵入让溶剂慢慢流出，继续侵入凝胶至沉降到所需高度。装凝胶至沉降到所需高度。装柱时要注意操作压。柱
4、时要注意操作压。c.用用3-5倍柱床体积的起始缓冲倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平衡，液走柱，使交换剂充分平衡，柱床稳定。柱床稳定。4.装柱装柱5.样品上柱、洗脱、样品上柱、洗脱、收集。收集。a.如图装好层析装置，打开下端出如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到凝胶口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶面胶面b.沿柱壁缓慢加入沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。冲液洗涤柱壁。c.打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。d.用自
5、动部分收集器自动或手动收用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。集，合并同一高峰各管。6.凝胶的再生及保存凝胶的再生及保存再生再生 用过的凝胶经用过的凝胶经0.5M的的NaOH和和HCl溶溶液分别处理后可以恢复其性能液分别处理后可以恢复其性能凝胶的保存方法凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠叠氮钠 或或0.002%双氯苯双胍己烷双氯苯双胍己烷a.分离蛋白质b.脱盐c.蛋白质分子量的测定应应用用 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳1原理原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N，N-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂
6、过硫酸铵(简称AP)或核黄素(VB2)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。1.1 1.1 聚丙烯酰胺凝胶优点聚丙烯酰胺凝胶优点1)化学性能稳定，对pH和温度变化不敏感；2)重复性好；3)灵敏度高，可达10-6 g；4)分辨率高。分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5分子量范围与凝胶浓度的关系1.2 1.2 凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密
7、切相关凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关1.3 1.3 种类种类1)连续系统与不目前常用的多为圆盘电泳(图1)和板状电泳(图2)，两者电泳原理完全相同。2)聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统两大类。图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶 pH 6.7 (2)浓缩胶 pH 6.7 (3)分离胶 pH 8.9 (4)电极缓冲液 pH 8.3图2 夹心垂直板电泳槽示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统图3 蛋白质微型电泳系统蛋白质微型电泳系统1.4 1.4 不连续体系由电极
8、缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成1)浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH 6.7的Tris-HC1。2)分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH 8.9 Tris-HC1。3)电极缓冲液是pH 8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。1)样品浓缩效应 A.凝胶孔径不连续性 B.缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 C.电位梯度的不连续性2)分子筛效应3)电荷效应1.5 1.5 不连续体系凝胶对蛋白的分离作用不连续
9、体系凝胶对蛋白的分离作用2.1 SDS-不连续体系凝胶制备不连续体系凝胶制备2.操作步聚操作步聚 试剂名称试剂名称 分离胶分离胶(8%)浓缩胶浓缩胶(4%)分离胶缓冲液分离胶缓冲液1.25 ml /浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液 /0.5 ml水水2.4 ml 1.2 mlTEMED 10 ul 5 mlAP 60 ul 25 ul聚丙烯酰胺凝胶配制聚丙烯酰胺凝胶配制操作步聚操作步聚2.2 样品处理样品处理适量浓度蛋白溶液加入适量浓度蛋白溶液加入1上样缓冲液上样缓冲液混匀，混匀，95水浴中处理水浴中处理5分钟。分钟。2.3 加样加样 用微量进样器取用微量进样器取10-15 l上述混合液，通过电上述混
10、合液，通过电极缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。极缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。2.4 电泳电泳将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，打开电泳仪开关，开始时电流为接，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待样品进，待样品进入分离胶后，将电流调至入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距，当溴酚蓝染料距硅胶框硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源。时，停止电泳，关闭电源。2.5 染色与脱色染色与脱色 电泳结束后，取下凝胶模，卸下电泳结束后，取下凝胶模，卸下胶框，用凝胶铲小心撬开短玻璃板，胶框，用凝胶铲小心撬开短玻璃板，从凝胶板上切从凝胶板上切下一角作为加样标记下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，在两侧溴酚蓝染料区带中心，加入染色液染色加入染色液染色1-2 h，再用脱色液脱色，直至蛋，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率白质区带清晰，即可计算相对迁移率2.6 结果处理结果处理 各蛋白质样品区带中心与加样端的距各蛋白质样品区带中心与加样端的距离离(cm)，按下式计算相对迁移率，按下式计算相对迁移率mR:蛋白质样品距加样端迁移距离蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)相对迁移率相对迁移率mR=
