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1、蛋白质双向电泳蛋白质双向电泳蛋白质组学 蛋白质组学：可视为分子生物学的大规模筛选技术，目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它们的关系与功能。Applications of proteomics Protein identification/characterization Protein-protein interaction Post-translational modifications Subcellular location Elucidation of pathway Target validation and toxicology Drug d
2、iscovery蛋白质组分析的首要要求 将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。生物学问题生物学问题的提出的提出实验模型实验模型的设计的设计实验组和对照组实验组和对照组样品的制备样品的制备蛋白样品的蛋白样品的IEF和和PAGE电泳分离电泳分离图像扫描和初步分析图像扫描和初步分析感兴趣感兴趣蛋白点蛋白点的切取的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发
3、现新蛋白质的发现其它实验其它实验的进一步的进一步验证验证蛋白信息的蛋白信息的初步获得初步获得蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备双向电泳双向电泳图像分析图像分析转印至膜上的蛋白转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白质质量蛋白质质量N端测序端测序肽序列质谱数据肽序列质谱数据肽指纹图肽指纹图数据搜索数据搜索新的或已知蛋白新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定蛋白转录后修饰的鉴定双向电泳分析中的样品制备制备原则制备原则：应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数
4、疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。待研究蛋白的可检测性。可溶性样品可溶性样品 固体组织样品固体组织样品 细胞细胞不同样品的基本处理方法不同样品的基本
5、处理方法样品的分级处理样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。样品的溶解 是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。溶解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。增加样品溶解性的手段增加
6、样品溶解性的手段变性剂：变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性剂：表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。还原剂：还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。起载体作用的两性
7、电解质：起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。样品液的准备标准液：ReagentAmount8M urea47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O50mM DTT or
8、2mM TBP385mg or 500ul of 200mM TBP stock4%CHAPS2g0.2%carrier ampholytesSee next table0.0002%bromophenol blue100ul of 0.1%stockddH2OTo 50mlIPG pH RangeBio-Lyte Ampholyte(stock)rangeBio-Lyte Ampholyte(stock)Conc.(w/v)Sample Solution VolumePer 5mlSample Solution VolumePer 50ml3-103/1040%25l250 l4-74/64
9、0%12.5 l125 l5/740%12.5 l125 l3-63/540%25 l250 l4/640%12.l125 l5-85/840%25 l250 l7-107/940%12.5 l125 l8/1020%25 l250 l Suggested Bio-lyte ampholyte composition for IPG useReagentAmount7M urea4.1ml of 8.5 stock or 2.1g urea in 3ml H2O2M Thiourea760mg2mM TBP50ul of 200mM TBP stock4%CHAPS200mg0.2%carri
10、er ampholytesSee table0.0002%bromophenol blue10ul of 0.1%stockddH2OTo 5mlMultiple chaotropic agent solution preparationReagentAmount5M urea2.9ml of 8.5 stock or 1.5g urea in 3ml H2O2M Thiourea760mg2mM TBP50ul of 200mM TBP stock2%CHAPS100mg2%SB3-10100mg0.2%carrier ampholytesSee table40mM Tris24.2mg0.
11、0002%bromophenol blue10ul of 0.1%stockddH2OTo 5mlMultiple surfactant solution preparation样品中核酸的去除样品中核酸的去除 对电泳的影响：对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。亚蛋白质组样品的制备亚蛋白质组样品的制备用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对
12、分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。顺序抽提法：顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。第一步：用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用标准IEF样品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。特殊样品的制备特殊样品的制备 低丰度蛋白的分离：低丰度蛋白的分离：尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级窄pH
13、胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。强碱性蛋白质（如核糖体）的处理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH312、4-12或10-12）进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12）的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12）等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。极端分子量的蛋白质：极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的dodelcy
14、l sulfate ions持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。一维固相一维固相pH梯度等电聚焦（梯度等电聚焦（IEF with IPG）：）：IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH310不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙
15、烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。IPG胶条的重泡胀胶条的重泡胀 泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF。不同的加样方法和加样量会导致最终结果的差异：Protean IEF cell、IPGphor等集成设备的使用：20mmol/L DTT 垫片的使用：温度的选择：蛋白载样量蛋白载样量影响影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括：胶条对蛋白载样量的因素包括：待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。电泳的目的：如果只是得到一张好的图片，则无需考虑太多其它
16、因素。待研究蛋白的丰度：样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。IPG胶条的pH范围：IPG胶条的蛋白质大约载样量胶条的蛋白质大约载样量IPG Strip lengthAnalytical Load(silver staining)Preparative Load(Coom staining)7cm10100 g/125 l 200500ug/125 l11cm50200 g/185 l 2501000ug/185 l17cm100300 g/300 l13mg/300 lIPG IEF 中中pH梯度的选择梯度的选择 常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。预分步预分步收集收集细胞浆细胞浆细胞核细胞核 细胞膜细胞膜核糖体及其他核糖体及其他特定细胞成份特定细胞成份细胞分细胞分泌成份泌成份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-10pH6-11pH3-6pH3-4pH4-5pH5-6pH6-7pH7-8pH8-9pH9-10pH10-11pH11-12第一步第一步第二步第二步第
