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1、 浙江中医药大学浙江中医药大学 生命科学学院生命科学学院蛋白质含量测定蛋白质含量测定 引言：引言：蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。v 目前测定蛋白质含量的方
2、法有很多种，目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：白质测定方法：v物理性质：紫外分光光度法。物理性质：紫外分光光度法。v化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法等。法等。v染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。v其他性质：免疫比浊法。其他性质：免疫比浊法。蛋白质的定量测定双缩脲法v实验目的要求实验目的要求v 1、学习分光光度法原理，了解分光光度、学习分光光度法原理，了解分光光度计的结构。计的结构。v 2、掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理、掌
3、握双缩脲法测定蛋白质含量的原理及方法。及方法。v 3、了解标准曲线的制作方法及其在物质、了解标准曲线的制作方法及其在物质定量测定中的应用。定量测定中的应用。分光光度法原理 分光光度法，常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其基本原理是根据Lambert和Beer定律。Lambert定律定律 v 一束平行单色光垂直照射于一均匀物质（溶液）时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光线强度的减弱也愈显著。v 设：入射光强度为I0 L表示溶液的厚度（即光程）出射光（透过光）强度为Iv根据辐射能理论推导，I0与I之间关系为v lg（I0/I）=K1L （1）v
4、 K1是常数，受光线波长、溶液性质、溶液浓度的影响。Beer定律定律 v 当一束单色光通过一溶液时，光能被溶液介质吸收一部分，若溶液的厚度不变，则溶液浓度C愈大，光吸收愈大，透射光线强度的减弱也愈显著，光强度减弱的量与溶液浓度增加量成正比v lg（I0/I）=K2C （2）v K2为吸收系数，是常数，溶液对光吸收的大小与溶液浓度C成正比。Lambert-Beer定律（又称吸收定律）定律（又称吸收定律）v上二式合并（即（l）与（2）合并）v lg（I0/I）=CL v令A=lg（I0/I），T=I/I0；则 A=CL，A=-lgT。v T为透光率，A为吸光度（光密度、消光度）。v 其中为常数，又
5、称消光系数（extinction coefficient），表示物质对光线吸收的能力，其值因物质种类和光线波长而异。对于相同物质和相同波长的单色光则消光系数不变。分光光度计的结构分光光度计的结构 v光源：光源：钨灯和氢灯（或氘灯）v单色器单色器：分解为单一波长光的装置 v狭缝：狭缝：调节入射单色光的强度，形成平行光 线 v吸收池：吸收池：又称比色杯、比色皿、比色池，装待测溶液用 v检测系统：检测系统：感受光能，转化为电能，输出A值、T值。本室几类分光光度计22PC型可见光分光光度计 UNICO2000型 S54型紫外分光光度计 UV8500型紫外分光光度计 比色杯（比色皿）玻璃比色杯 石英比色
6、杯 荧光比色杯比色杯使用注意事项 1、拿取比色皿时，只能用手指接触两侧的毛玻璃，避免接触光学面。2、不得将光学面与硬物或脏物接触。盛装溶液时，高度为比色皿的2/3处即可，光学面如有残液可先用滤纸轻轻吸附，然后再用檫镜纸擦拭。3、比色皿在使用后，应立即用水冲洗干净。必要时可用1：1的盐酸浸泡，然后用水冲洗干净。4、不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤；5、在测量时如对比色皿有怀疑，可自行检测。微量移液器v吸嘴装在吸液杆上，应套牢避免间隙。v依据所需容量旋转手轮，使数轮显示所需值。v轻轻地将推动按钮下压，使推动按钮推移至第一停点位置。v手持取液器垂直浸入溶液中，吸嘴浸入深度为2-4m
7、m，停留2-3秒后缓慢放松按钮，即回到原来位置，溶液吸入后稍停即可将吸嘴移出液面。v将取液器吸嘴置于排液容器内。使吸嘴尖紧贴容器内壁，按压推动按钮至第二停点位置，使溶液排尽，松开按钮。v移液完毕，按压卸嘴按钮，将吸嘴脱卸。v【实验原理实验原理】v具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。v N HON HN HON HCCN HON HON HCC加 热 1 8 0 Co+N H2222223v紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：v v 但必须注意，此
8、反应并非蛋白质所特有，但必须注意，此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物以及分子内有以及分子内有H2NOC-NH-CONH2等结构化等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性。合物，双缩脲反应也呈阳性。v v【实验材料实验材料】v 1试剂试剂v（1）双缩脲试剂：取）双缩脲试剂：取1.50g硫酸铜硫酸铜（CuSO45H2O）和）和6.0g酒石酸钾钠酒石酸钾钠（NaKC4H4O64H2O），用），用500mL水溶解，水溶解，在搅拌下加入在搅拌下加入300mL 10氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液，1.0g KI；用水稀释到；用水稀释到1000mL，贮存
9、于塑料，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中），避光保存。瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中），避光保存。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色或暗此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色或暗红色沉淀出现，则需重新配制。红色沉淀出现，则需重新配制。v v2标准和待测蛋白质溶液：标准和待测蛋白质溶液：v（1）标准蛋白溶液标准蛋白溶液：10mg/ml牛血清白蛋牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）。作为标准用氢氧化钠溶液配制）。作为标准用的蛋白质要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白的蛋白质要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度称量，配制成标
10、准溶液。质含量，根据其纯度称量，配制成标准溶液。v（2）待测蛋白质溶液）待测蛋白质溶液：测定血清等样品时测定血清等样品时需做适当稀释，使其浓度在标准曲线测试范需做适当稀释，使其浓度在标准曲线测试范围内。围内。v3器材器材 v试管、试管架、刻度吸管、微量移液器、旋试管、试管架、刻度吸管、微量移液器、旋涡混合器、涡混合器、22PC型、型、UNICO2000型可见分型可见分光光度计、光光度计、S54型、型、UV-8500型紫外分光光型紫外分光光度计。度计。v【实验方法实验方法】v1制作标准曲线制作标准曲线v 取取6支干燥洁净试管编号，按下表加入下列试剂：支干燥洁净试管编号，按下表加入下列试剂：v 加
11、入物（ml）012345标准蛋白液/ml 00.20.40.60.81.0蛋白浓度/(mg/ml)02.04.06.08.010.0蒸馏水/ml 1.00.80.60.40.20.0双缩脲试剂/ml 4.04.04.04.04.04.0充分混匀后，室温下（2025）放置30min A540 v采用标准曲线法，即采用标准曲线法，即A540(540nm吸光度值吸光度值)为纵坐标，蛋白为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。质浓度为横坐标，绘制标准曲线。v2样品测定样品测定v 取取2支试管，加入待测样品液各支试管，加入待测样品液各1ml，加入双缩脲试剂，加入双缩脲试剂4ml，室温下（室温下（20
12、25）放置）放置30min，用分光光度计测定吸光度。，用分光光度计测定吸光度。v3.结果结果v由测得的吸光度在标准曲线上查得样品浓度。以由测得的吸光度在标准曲线上查得样品浓度。以mg/ml计。计。v【注意事项注意事项】v1本实验方法测定范围本实验方法测定范围110mg/ml蛋白质。蛋白质。v2各管由显色到比色的时间应尽可能一致。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。v3有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。溶液澄清后离心，取上清液再测定。实验报告书写要求按以下序列书写：1 实验目的2 实验原理3 实验材料4 实验步骤5 实验结果与分析
