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1、文件修改记录版本修订次数修订日期修订内容002011-02-14A12012-05-25修订分发号:（仅适用于控制文件）（仅盖有红色印章的文件才有效）1.O目的规定大肠杆菌计数的方法。2.0适用范围适用于加多宝凉茶、浓缩汁、工艺水等产品或原辅材料中的大肠杆菌群的计数。3.0术语3.1大肠菌群：一群在36C条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧格兰仕隐形无芽泡杆菌。3.2MPN最可能数（mostprobablenumber）:基于泊松分布的一种间接计数方法。40职责4.1质检部：负责按此方法对加多宝来凉茶、浓缩汁、工艺水等产品或原辅材料中大肠菌群进行计数。5.0流程图见附录A、附录
2、B。6.0内容及要求6. 1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下：6.1.1 恒温培养箱：36oCloC6.1.2 冰箱：2oC-5C6.1.3 恒温水浴箱：460CrC6.1.4 天平：感量0.1g6.1.5 振荡器6.1.6 无菌吸管：Iml（具0.01刻度）、IOml（具0.1刻度）或微量移液器及吸头。6.1.7 无菌锥形瓶：容量500InI6.1.8 无菌试管：18200ml6.1.9 小导管6.1.10 无菌培养皿：直径90m6.1.11 菌落计数器6. 2培养基和试剂6.1.1 月桂基硫酸盐胰蛋白豚（LST）肉汤6.1.2 煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤6
3、.1.3 乳糖胆盐发酵培养基（LBB）6.1.4 乳糖蛋白月东培养基（LPB）6.1.5 伊红美蓝琼脂培养基（EMB）6.1.6 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）6.1.7 75%乙醇溶液6.1.8 无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于100Oml蒸馄水中，121高压灭菌15min6.3大肠菌群MPN计数法6.3.1加多宝凉茶、浓缩汁等产品及原辅材料中大肠菌群的测定6.3.1.1样品稀释a、固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225ml无菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打b2min,制成L10的样品匀液。b、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置于盛有225ml的无菌生理盐水的无
4、菌锥形瓶中，充分混匀，制成L10的样品匀液。c、用Iml无菌吸管吸取1：10样品匀液ImL沿管壁缓慢注入盛有9ml无菌生理盐水的试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，制成1：100的样品匀液。d、根据对样品污染状况的分析，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样晶匀液。注意每递增稀释依次，换用一次InlI灭菌吸管。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min6.3.L2初发酵试验a、每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸胰蛋白陈（LST）肉汤，每管接种IInl（如果接种量超过1ml,则用双料LST肉汤）。b
5、、将以上接种好的试管置于361培养242h,观察导管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至482h.记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。6.3.1.3复发酵试验用接种环从所有482h内发酵产气的LST肉汤中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，361C培养482h,观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。6.3.1.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表（见附录C）,报告每克（或每毫升）样品大肠菌群的MPN值。6.3.2工艺水等水样中大肠菌群的测定6.3.2.1推测性试验a、取待检样品I
6、OmL接种到IOml双料的乳糖胆盐发酵培养液或乳糖蛋白陈培养液中，共接种5管；对于可能存在污染的水源，取待检样品IOm1、1ml、0.Iml（取样品Inll于9ml无菌生理盐水中稀释，取稀释后的样液ImD,分别接种于含IOml双料、单料和单料乳糖胆盐发酵培养液或乳糖蛋白陈培养液中，各接种5管。b、如果水样污染较严重，应加大稀释度，可接种ImK0.ImK0.01ml甚至0.1ml、0.01ml0.001ml,每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种IlnI一下水样时，必须做10倍递增稀释后，取Inll接种，每递增稀释一次，换用1支ImI灭菌刻度吸管。c、将以上接种好的试管置于361C培养箱
7、内培养242h,如所有乳糖胆盐发酵管或乳糖蛋白陈发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。6.3.2.2确证性试验6.3.2.2.1方法一a、分离培养将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置于36土1升华培养箱内，培养18-24h取出。观察菌落形态，用接种换挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。菌落呈深紫黑色，表面有金属光泽；紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色、中心较深的菌落。b、证实试验经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽胞杆菌，同时接种乳糖胆盐发酵管内，置于361C升华培养箱培养242h,有产酸产气者，即证实有大肠菌群存在。6.3.2.
8、2.2方法二自推测性检验阳性管中取1接种环培养液，接种到煌绿乳糖胆盐(BGLG)肉汤中，置于361C培养箱内培养48h。观察BGLG管中的产气情况，如有气味产生，就可确定为大肠菌群阳性，如无则为大擦汗那个菌群阴性。6.3.2.3结果报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，可得出水样中大肠菌群的MPN值。5管法见附录E。稀释样品查表后所得结果应乘以稀释倍数。如所有乳糖胆盐发酵管均为阴性时，可报告大肠菌群未检出。6. 4大肠菌群平板计数法6.1.1 样品稀释按6.3.1.1执行6.1.2 平板计数1. 4.2.1选取1-3个适宜的稀释度(液体样品可以选用原液)接种两个无菌平皿，每皿1ml
9、,同时分别取ImI无菌生理盐水加入到两个无菌平皿作空白对照。6. 4.2.2及时将冷却至46C的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)15-20ml倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后再加3-4ml结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)覆盖平板表层。翻转平板，置于361培养箱内培养18-24ho7. 4.2.3选取菌落数在30-150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑的大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落至今岗位0.55mm或更大。6.1.3 证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，361C
10、培养箱内培养24T8h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。6.1.4 平板计数法的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以6.2.2.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克(或每毫升)样晶中大肠菌群数。例：10样品稀释液Inil,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100X(6/10)X1(g/ml=6.OX10CFU/g(CFUml)7.0质量记录7. 1KJWIF-QA-34成品检测记录附录A大肠菌群MPN计数检验程序附录B大肠菌群平板计数检验程序附录C大肠菌群最可能数（M
11、PN）检索表每克（或每亳升）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索见卜表：阳性管数MPN95%可信限阳性管数MPN95%可信限0.10.010.001下限上限0.10.010.001下限上限0001100420注1：本表采用3个稀释度O.Ig（或0.1ml）、0.01g（或0.0InII）和0.OOlg（或0.OOlmD,每个稀释度接种3管。注2：表内所列检样量如改用Ig（或Iin1）、0.Ig（或0.1ml）和0.0Ig（或0.0ImI）时，表内数字应相应降低10倍,如改用0.0Ig（或0.01ml）、0.OOlg（或0.001ml）、0.OOOlg（或0.000ImI）时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。附录D大肠菌群MPN检索表（用5管IOml水样时各种阳性和阴性结果组合的MPN值及其95%的可信性）阳性反应管数MPN/100ml95%可信限下限上限000612.20.112.625.10.519.239.21.629.44163.352.95168无限附录E大肠菌群MPN检索表（总接种量55.5ml,其中5份IOml水样，5份Iml水样，5份0.Iml水样）接种量/ml大肠菌群(MPN/100mD接种量/ml大肠菌群(MPN100ml)1010.110
