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1、肺结核痰涂片检查工作规范肺结核痰涂片检查工作规范肺结核痰涂片检查工作规范痰涂片检查是肺结核病人诊断与鉴别诊断、制定化疗方案、疗效考核的主要方法或手段。为贯彻落实市卫生局关于在全市一级以上医疗单位中开展传染性肺结核筛查工作的通知的精神，加强传染性肺结核病人发现力度，特制定本规范。一、痰检的对象和要求（一）对象1 .咳嗽、咳痰23周或有咯血或血痰症状以及胸片异常者。2 .进行疗效考核的病人：凡已确诊、登记、治疗的肺结核病人，在化疗期间应按规定定期作痰菌复查。D初治涂阳病人（含重症涂阴病人）在疗程满2、5、6个月时，复治涂阳病人在疗程满2、5、8个月时，各查痰一次。2）初、复治涂阳病人在疗程满2个月
2、时，痰菌仍为阳性者，应在治疗满3个月时增加查痰一次。3）确诊、登记的涂阴肺结核病人，即使病人因故未接受治疗，也应在登记后满2和6个月时进行痰菌检查。（二）要求1 .初诊病人应送3份痰标本（夜间痰、清晨痰和即时痰）。如无夜间痰，在留清晨痰后23小时再留取一份痰标本；或在送痰时，留取两份即时痰。治疗中或复诊随访病人按期每次送检两份痰（清晨痰和夜间痰）。2 .痰标本采集：即时痰为病人就诊时咳出的痰液。清晨痰为清晨深咳出的痰液。夜间痰为就诊前一天晚睡前咳出的痰液。痰标本应以脓样、干酪样或脓性粘液样性质的痰液为合格标本，痰量应为35毫升。应由检验人员或专人验收痰标本，痰液不合格者，要求重新送检。难以获得
3、合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注明标本性状以供分析结果时参考。痰标本的容器，应采用国家参比实验室推荐的国际通用痰瓶或采用直径4厘米、高2厘米的塑料或涂蜡纸密闭盒。留痰容器上应注明病人姓名、编号（门诊序号或病人登记号）及日期。3 .痰标本的保存和输送：痰标本容器密封，勿倒置，严防痰液外溢。不能立即作涂片检查的痰标本，须置4C冰箱保存，防止痰液干涸或污染。需送上一级细菌实验室培养的痰标本，外送前应认真核对痰标本容器上标注，是否正确和清晰，是否与化验单一致。痰容器应采用专用的结核杆菌和痰标本冰盒运送，或以纸张和塑料袋封装、扎牢顺序放置于包装袋内。盒外注明勿倒置标志。4 .送检时，县（市、区）结
4、防所（科）医师应填写检验单。填写项目包括：病人姓名、地址、登记号（或门诊序号）、送检日期（或初诊日期）、送检原因（初诊病人或随访病人）。检验单应与痰标本分别放置在不同容器中，一齐送交上级实验室。5,收到痰标本后，实验室检验人员仔细核对标本和检验单各项内容，查看痰标本是否合格。随后按顺序编号，及时检查和登记。6.废弃标本和污染物的处理：1）痰盒和废弃标本等污染物，均须经高压蒸汽灭菌后才能丢弃或清洗，严禁不经灭菌随意处理。2）痰盒等污染物如采用焚烧处理，须置于焚烧炉内彻底焚化。焚化不彻底，或暴露焚烧是有害的。3）痰检工作台面的消毒：可将痰标本置于一搪瓷盘中，在操作厨中进行痰涂片操作。涂片操作完成后
5、，将盘与废弃物等一并进行高压蒸汽灭菌，或与操作台面同时以3%石碳酸或其它可靠的消毒液擦拭后，再以紫外线灭菌灯（距离1米）照射30分钟。二、痰直接涂片检查法（一）涂片取经95%乙醇擦拭脱脂过的干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻璃片，于玻片背面的左端1/3处以蓝色或黑色记号笔（玻璃铅笔）编号。用接种环或折断的竹签茬端，挑取痰标本的脓样、干酪样部分约0.050.ImL于玻片正面的右侧三分之二处均匀涂抹成2X2.5厘米卵圆形痰膜。自然干燥后待检。一张玻片只可涂抹一份标本。玻片只应使用一次，不得清洗后再次使用。（二）萋尔尼尔逊氏染色法（ZiehlNeelsen）简称萋尼氏染色法：1.试剂：1）碱性复红乙醇
6、染色储存液：碱性复红液：8克碱性复红溶于95%乙醇100毫升中。5%石碳酸水溶液：5克石碳酸溶于100毫升蒸储水中。2）碱性复红乙醇染色液：10毫升碱性复红储存液与90毫升5%石碳酸水溶液混合。3） 5%盐酸乙醇脱色液：5毫升浓盐酸与95毫升95%乙醇混合。4） Oo3%亚甲兰复染储存液：0.3克亚甲兰溶于50毫升95%乙醇中，完全溶解后加蒸储水至终体积100毫升。5）亚甲兰复染液：以蒸储水10倍稀释0.3%亚甲兰复染储存液即得亚甲兰复染液。2 .染色步骤：D火焰固定涂片。2）滴加碱性复红乙醇染色液，盖满痰膜。小心火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色三分钟。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆
7、盖，必要时可续加染色液。切勿使染色液沸腾。3）流水自玻片背面上端轻洗，洗清染色液。4）自痰膜上端外缘滴加脱色液，流过痰膜。需脱至痰膜无可视红色为止。脱色应单片进行。5）流水自玻片背面上端轻洗，去脱色液。6）滴加亚甲兰复染液，染色30秒钟。7）流水自玻片背面上端轻洗，去复染液。8）待干后镜检。3 .镜检与报告：光学显微镜镜检（目镜1OX,油镜IOoX）染色痰片。在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其它细菌和细胞呈蓝色。按照下列标准报告所得结果：D抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。2）抗酸杆菌可疑（土）：12条抗酸杆菌/300个视野。3）抗酸杆菌阳性（1+）：39条抗酸杆菌/10
8、0个视野。4）抗酸杆菌阳性（2+）：19条抗酸杆菌/10个视野。5）抗酸杆菌阳性（3+）：19条抗酸杆菌/每个视野。6）抗酸杆菌阳性（4+）：210条抗酸杆菌/每个视野。镜检结果，应及时记录在“结核病细菌学实验室登记本“和化验报告单上。痰涂片化验单应包括痰标本的性状。阴性结果应填记“阴性”不得以“（）”表达。300个视野内仅见12条抗酸杆菌者，应在报告单上注明条数，医生可结合胸片进行判断。必要时再取标本复查证实，仍见12条抗酸杆菌/300个视野，该病例可确诊为涂阳病人。标本应在送检48小时内报告结果。三、痰涂片质控工作为了进一步提高痰检涂片及诊断水平，市疾控中心每年两次组织专家对市（县）、区疾
9、控中心痰片制做质量和诊断水平进行抽查。扩展阅读：乡镇卫生院结核病痰涂片检查点设置及实验室操作规程附件：乡镇卫生院结核病痰涂片检查点设置及实验室操作规程在以县（市）为单位实施现代结核病控制策略（DOTS）的地区，通过在乡镇卫生院设结核病痰涂片检查点（以下简称查痰点），方便肺结核可疑症状者和疑似肺结核病人的就诊查痰，以达到提高涂阳肺结核病人发现率，缩短传染性肺结核病人的就诊延误和治疗延误时间，降低结核病传播的目的。一、乡镇卫生院查痰点工作职责（一）乡镇卫生院查痰点负责辖区及周围乡镇肺结核可疑症状者和疑似肺结核病人的痰检工作。（二）查痰点是结核病诊断的初筛单位，凡痰涂片阳性病人或痰涂片阴性但高度怀疑
10、肺结核者需转至县级结防机构进一步检查确诊。（三）镜检阳性的痰涂片2日内应得到县级结防机构实验室确认，阴性涂片一周内应得到县级结防机构实验室的复验。痰涂片的转送方法可根据当地情况决定。（四）乡镇卫生院查痰点实验室须按要求做好痰涂片保存和各项资料的登记、统计管理工作。二、查痰点的基本要求（一）痰涂片检查点首先应做好实验室工作用房的准备，根据乡镇卫生院现有工作用房进行合理调整和布局。实验室面积不小于10平方米，按功能划分为操作区，用于痰涂片制备、染色，相对洁净区，用于镜检、登记等（见图1）。（八）供收集痰标本使用；（B）痰涂片制备；（C）染色池；（D）洗手池；（E）显微镜读片；（F）实验室登记和痰涂
11、片储存图L痰涂片检查实验室基本布局（二）依据病原微生物实验室生物安全管理条例规定，查痰点实验室须具备开展痰涂片检查工作的水源、消毒、污物处理等一般检验条件。（三）查痰点需有专人负责，技术人员须经培训合格后方可从事痰涂片检查工作（附表1）。（四）查痰点需配备双目显微镜一台（含100倍油镜）和紫外线灯；上级结核病防治机构统一配备的染色试剂、登记本、检验单、玻片、痰盒等日常工作物品。（五）已具备上述基本条件的查痰点，经地（市）级和县级结核病防治机构验收合格，并经县级结核病防治机构上报省、地（市）级结防机构备案后即可开展工作（附表2）。三、检查对象就诊及转诊的疑似肺结核病人,一般包括持续咳嗽、咳痰超过
12、3周；咳血或伴有血痰；发热或胸痛超过2周；胸部X线检查异常。四、检查程序（一）接诊病人：对所有肺结核可疑症状者和疑似肺结核病人，应在内科或呼吸科门诊进行登记，由门诊医生开具三张痰涂片检查单（附表3）。（二）痰标本收集：在三个痰标本盒上注明病人的姓名、编号、检查日期和容器序号。病人首次留痰前应指导病人，留取“即时痰”、“夜间痰”、“晨痰”合格的痰标本，对所送不合格痰标本除常规检查外，应要求患者重新送检。（）实验室登记：按照年度病人序号和痰标本序号在实验室登记本上进行登记（见附表4）,并以同样的号码在痰涂片检查单上进行标记。检验单的病人姓名应与实验室登记本一致。（四）痰涂片检查：对病人送的痰标本应
13、及时按操作规程进行涂片、染色和显微镜检查。（五）痰涂片检查结果登记与报告：及时在登记本上登记痰涂片检查结果。当病人的三次痰涂片检查完成后，发现有阳性痰涂片，应在规定时间内报县结核病防治机构，县级结核病防治机构应及时对痰涂片进行确认。（六）痰涂片的保存：每个查痰点镜检后的全部痰涂片应按实验室登记本序号连续排列，分别存放在各点固定的玻片盒中，供上级实验室复核确认。（七）痰检质量控制：每个痰涂片检查点均按照中国结核病防治规划痰涂片镜检质量保证手册的要求，作为一个独立的被质控单位接受室间质量评估和检查工作。五、痰涂片抗酸染色检查法（一）痰标本的采集肺结核可疑症状者或肺结核病人送痰时，医护人员或痰检人员
14、应向病人解释，使病人充分了解留好痰标本的重要性，并指导病人如何从肺部深处咳痰。采集痰标本时应在远离人群的开放空间进行，或在通风良好的室内进行。标本量一般在35mlo1、痰标本盒：应采用WHO推荐的国际通用螺旋盖痰瓶，或可密封塑料盒、蜡纸盒收集痰标本。痰标本盒上注明病人姓名、编号、检查项目和容器序号“1”、“2”、“3”（1为当日即时痰，2为夜间痰，3为次日晨痰）。2、痰标本的性状：合格的痰标本应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物。合格的痰标本包括干酪痰、血痰、粘液痰。唾液或口水用于病人确诊时为不合格痰标本。（1）干酪痰标本外观以黄色（或奶酪色）、脓样、团块状的肺部分泌物为主，粘度较粘液痰低
15、，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可发现大量脓性炎症细胞、肺上皮脱落细胞。由于此类标本是由肺部深处咳出，对肺结核的诊断最有价值，故抗酸杆菌阳性检出率较高。（2）血痰此类标本是因粘液痰或干酪痰标本中混有血液而形成，颜色为褐色或深褐色、鲜红色或伴有血丝；涂片染色后镜检除能够观察到粘液痰或干酪痰的细胞特征外，含新鲜血液的标本中可见到被染色的血细胞。由于含血标本易干扰抗酸杆菌镜检的结果，故在制片时应尽量避免挑取含血标本。（3）粘液痰标本外观以白色、粘稠度较高的肺部和支气管分泌物为主，制片时需仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞，伴有少量肺上皮脱落细胞、脓性炎症细胞、口腔脱落细胞及口腔寄生菌。此类标本的抗酸杆菌阳性检出率较唾液高。(4)唾液目视观察标本整体外观，以透明或半透明水样、粘度较低的口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可见少量口腔上皮脱落细胞和口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。由于此类标本进行抗酸杆菌检查时的阳性检出率很低，用于对患者确定诊断时是不合格的标本。所以，当病人初次留痰即为唾液时，应嘱病人重送并指导病人如何留取合格标本。3、痰标本采集时间：根据痰标本的采集时间，将痰标本分为三类：(1)即时痰病人就诊时深呼吸后咳出的痰液。应确保每个初次就诊病人均留取即时痰进行检查。
