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1、第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术 第五章第五章 代谢物酶法分析技术代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术2代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。定人体內的代谢物或代谢产物的技术。酶法分析（酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶促）是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利用反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利用酶促反应测定酶活性的一类方法。酶促反应测定酶活性的一类方法。代谢物酶法分析技术的概念代谢物酶法分析技术的概
2、念第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术3 代谢物酶法分析代谢物酶法分析 平衡法（终点法）平衡法（终点法）速率法（动力学法）速率法（动力学法）代谢物酶法分析的理论基础代谢物酶法分析的理论基础1第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术4平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小（渐被消耗，当剩余的底物量很小（1%5%）时，指示）时，指示反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称为终点法为终点法(end-point method)。平衡法的特点是测定
3、底物的总变化量，平衡法的特点是测定底物的总变化量，即测定的是即测定的是“浓度浓度”。平衡法基本理论平衡法基本理论(1)第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术5速率法速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法，测又称动力学法、连续监测法，测定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的消耗量较小时消耗量较小时(5%)，酶促反应呈一级反应，此时的，酶促反应呈一级反应，此时的反应速度反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。与代测物的浓度成正比例。速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。速率法基本
4、理论速率法基本理论(2)第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术6在临床操作中，只要测定期间待测物消耗在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 Km2，这时的酶促反应动力学可按单底，这时的酶促反应动力学可按单底物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应动力学。动力学。但在以但在以NADH 或或NADPH 为底物的终点法测定中，为底物的终点法测定中，因因340 nm 吸光度吸光度的限制，辅酶的用量不可能过高。的限制，辅酶的用量不可能过高。第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术12在在340 nm 处测定吸光度的处测定吸光度的增加来进行定
5、量的方法增加来进行定量的方法乳酸测定乳酸测定双底物反应直接测定法双底物反应直接测定法 LD乳酸乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+丙酮酸测定丙酮酸测定 在在340 nm 处测定吸处测定吸光度的下降来进行定量的方法光度的下降来进行定量的方法 乳酸乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+LD第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术13酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分，酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分，将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检测目的的方法称酶促偶联法。检测目的的方法称酶促偶联法。最常用的偶联指示系统有两
6、个：一个是脱氢酶最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。ACBAEiEa 酶偶联法酶偶联法(2)第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术14脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 氧化型辅酶氧化型辅酶NAD(P)+在在340 nm 处没有吸处没有吸收峰收峰,还原型辅酶还原型辅酶NAD(P)H在在340 nm 处有吸收峰处有吸收峰.第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术15脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶(NAD+)或氧化型辅酶或氧化型
7、辅酶(NADP+)变为还原型变为还原型NAD(P)H后在后在340 nm 处的吸光度增高来计算出被处的吸光度增高来计算出被测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型NAD(P)H 变为氧化型变为氧化型NAD(P)+，测定，测定340 nm 处处吸光度的下降来计算被测物的浓度。吸光度的下降来计算被测物的浓度。第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术16脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 血清葡萄糖己糖激酶法测定血清葡萄糖己糖激酶法测定 Glu+ATPG-6-P+ADPPDG 6G-6-P+NADP+P-6-GA+NADPH+H+指示酶反应将指示酶反
8、应将NADP+转化为转化为NADPH+H+，测定，测定340 nm吸光度上升的吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比速度与葡萄糖的含量成正比 第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术17脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 血清尿素测定血清尿素测定 尿素尿素+H2O 尿素酶2NH3+CO2NH3+-酮戊二酸酮戊二酸+NADH+H+谷氨酸谷氨酸+H2O+NAD+测定测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正吸光度下降的速度与尿素的含量成正比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定 第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术18常用的试剂酶有乳酸脱氢酶
9、、谷氨酸脱氢酶、常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示系统。系统。脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术19过氧化物酶指示系统过氧化物酶指示系统 共用的指示反应共用的指示反应最早由最早由Trinder氏氏等人提出，被称等人提出，被称为为Trinder
10、反应反应 最大吸收峰为最大吸收峰为500nm，在可见光范围内比色。，在可见光范围内比色。已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三酯等项目的测定三酯等项目的测定 第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术20过氧化物酶指示系统过氧化物酶指示系统 血清总胆固醇氧化酶测定法血清总胆固醇氧化酶测定法 COD胆固醇酯胆固醇酯+H2O胆固醇胆固醇+O2胆固醇胆固醇+脂肪酸脂肪酸4-胆甾烯酮胆甾烯酮+H2O2红色醌类化合物红色醌类化合物H2O2+4-AAP+酚酚指示酶反应生成的红色醌类指示酶反应生成的红色醌类化合物可在化合物可在500 nm 处比色测定处比
11、色测定 第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术21化学名化学名英文缩写英文缩写最大吸收峰最大吸收峰（nm）酚酚2，4-二氯酚二氯酚N-乙基乙基-N-（3-甲苯）甲苯）-N-乙酰乙二胺乙酰乙二胺N-乙基乙基-N-（2-羟基羟基-3-丙磺酰）间甲苯胺丙磺酰）间甲苯胺N-乙基乙基-N-（3-丙磺酰）丙磺酰）-3，5二甲氧基苯胺二甲氧基苯胺P2，4-DCPEMAETOOSESPDMA500510555555585过氧化物酶指示系统过氧化物酶指示系统 常用的常用的Trinder反应生色基团反应生色基团 表内这些酚类衍生物，有的是提高生色基团的稳定性和溶解度、表内这些酚类衍生物，有的是提高生色基
12、团的稳定性和溶解度、产物的灵敏度和稳定性；有些生色基团的产物是兰色醌类，能避免溶产物的灵敏度和稳定性；有些生色基团的产物是兰色醌类，能避免溶血等色素干扰。血等色素干扰。第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术22利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。酶循环法酶循环法(enzymatic cycling a
13、ssay)的灵敏度决定的灵敏度决定于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两种试剂酶种试剂酶(Ea 和和Eb)的量。该法测定中所选择酶的的量。该法测定中所选择酶的Km 值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。酶循环法酶循环法(3)第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术23使用两种酶，即一种氧化酶用于靶物质的氧化，一使用两种酶，即一种氧化酶用于靶物质的氧化，一种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质(或其衍生或其衍生物物)或靶物质的氧化产物作为底物循环。或靶物质的氧
14、化产物作为底物循环。检测指示系统：检测指示系统：循环前、后用速率法测定循环前、后用速率法测定NADH(340 nm)的变化。检测产物的变化。检测产物H2O2可通可通过过Trinder 反应比色测定。反应比色测定。产物循环氧化酶脱氢酶系统产物循环氧化酶脱氢酶系统 第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术24产物循环氧化酶脱氢酶系统产物循环氧化酶脱氢酶系统 甘油浓度测定 通过通过GPO和和G-3PDH使使G-3P 与与DHAP之间循环，在反复之间循环，在反复循环中循环中G-3P 和和DHAP 的量不变，而产物的量不变，而产物H2O2 随每次循环随每次循环不断递增，同时不断递增，同时NADH
15、 递减。在规定时间递减。在规定时间t 内，内，H2O2 累计累计的量决定于的量决定于t 和每和每min循环次数。循环次数。第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术25底物循环脱氢酶辅酶系统底物循环脱氢酶辅酶系统用一种脱氢酶和两种辅酶用一种脱氢酶和两种辅酶(thio-NAD+和和NADH)。用用395 nm 415 nm 波长测定反应中氧化型波长测定反应中氧化型thio-NAD+转为还原型转为还原型thio-NADH的增加的增加速度。速度。循循环反应条件：环反应条件：酶对酶对thio-NAD+和和NADH应有高度亲和力。应有高度亲和力。溶液溶液pH 和缓冲体系同时有利于双向反应。和缓冲体
16、系同时有利于双向反应。thio-NAD+和和NADH 二者的浓度和配比达最适条件。二者的浓度和配比达最适条件。第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术26底物循环脱氢酶辅酶系统底物循环脱氢酶辅酶系统血淸胆汁酸测定血淸胆汁酸测定 胆汁酸与胆汁酸与3-酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代还原型辅酶还原型辅酶（黄色），控制好条件，反应速度与代测（黄色），控制好条件，反应速度与代测物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术27氨循环合成酶脱氢酶系统氨循环合成酶脱氢酶系统 NH4+在在NAD合成酶和合成酶和Mg2+存在下催化脱氨存在下催化脱氨-NAD转转化为化为NAD+，经脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和，经脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和NH4+同时生成同时生成NADH，生成的，生成的NH4+进入循环再次生成进入循环再次生成NADH，在，在340nm测定。测定。第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术28酶循环法具有的特点酶循环法具有的特点 灵敏度随反应时间的延长而提高
