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1、抗(抑)菌试验1目的测定抗(抑)菌产品对细菌和真菌的抗(抑)菌作用。常使用的方法有抑菌环试验、最小抑制浓度测定试验、滞留抑菌效果测定试验、洗衣粉抗菌效果测定试验、振荡烧瓶试验、浸溃试验与奎因试验，可视情况选用。2抑菌环试验2.1 原理利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。试验通过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。本试验适用于抑菌剂与溶出性抗(抑)菌产品的鉴定。2.2 试验器材(1)金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌(ATeCIO231)菌悬液(见2.1.1.2)及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌悬液。(2)抑菌剂载体(5mm直径园形新
2、华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后，置120烤干2h,保存备用)。(3)活菌培养计数所需器材(见2.1.1.3)。(4)微量移液器(5l50L可调式)。(5)游标卡尺。(6)营养琼脂培养基、胰蛋白陈大豆琼脂培养基与沙堡琼脂培养基2.3 操作程序抑菌片的制备:对液体抑菌剂，取无菌并干燥的滤纸片。每片滴加实际使用浓度抑菌剂溶液20l,然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置温箱(37。C)中烤干，或置室温下自然干燥后备用。溶出性抗(抑)菌产品，可直接制成直径为5mm,厚不超过4mm圆片(块)，每4片一(块)一组。(2)阴性对照样片的制备:取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸储水20l,干燥后备用
3、。溶出性抗(抑)菌产品的阴性对照样本，应取同种材质不含抑菌成份的样品，制成与试验组大小相同的样片(块)。(3)试验菌的接种:用无菌棉拭子蘸取浓度为5105cfuml-5l06cfuml试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动60,最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥5mino(4)抑菌剂样片贴放:每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片，1片阴性对照样片，共5片。用无菌镒子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上。贴放好后，用无菌镒子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置37温箱，培养16h
4、18h观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径(包括贴片)并记录。试验重复3次。测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界。2.4 评价规定(1)抑菌作用的判断：抑菌环直径大于7mm者，判为有抑菌作用。抑菌环直径小于或等于7mm者，判为无抑菌作用。(2)3次重复试验均有抑菌作用结果者，判为合格。(3)阴性对照组应无抑菌环产生。否则试验无效。2.5 注意事项(1)每次试验均应设置阴性对照，不可省略。在报告中亦必须将对照组的结果列出。(2)接种用细菌悬液的浓度应符合要求。浓度过低，接种菌量少，抑菌环常因之增大；浓度过高，接种量过多，抑菌环则可减小。（3）应保持琼脂浓
5、度的准确性，否则可影响抑菌环的大小。（4）培养时间不得超过18ho培养过久，部分细菌可恢复生长，抑菌环变小。（5）抑菌环直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。故抑菌剂滤纸片应在试验当天制备。3最小抑菌浓度测定试验（琼脂稀释法）3.1 原理本试验采用琼脂稀释法将不同浓度的抑菌剂混合溶解在琼脂培养基中，然后点种细菌，通过细菌的生长与否，确定抗（抑）菌物质抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度（MinimalInhibitOryConCentration,MIC）o本方法适用于不溶性抗（抑）菌产品。3.2 试验器材（1）菌株金黄色葡萄球菌ATCC6538,大肠杆菌8099或ATCeIl229。
6、可根据抑菌剂的用途，选择特定的菌株。（2）水解酪蛋白琼脂培养基（MH）,称取38gMH琼脂培养基，溶于IooOml水中，加热至沸腾溶解，然后121C高压灭菌15min,置45C50C水浴备用，此培养基将用于对照试验。（3）0.03molL磷酸盐缓冲液pH7.2（4）加样器（ll10D0（5）45C50C水浴恒温箱。（6）吸管、试管、平皿。1.1 37培养箱。3.3 操作步骤（1）抗（抑）菌溶液的配制：以无菌操作取5ml或5g（固体研磨后）样品，放入45ml灭菌磷酸缓冲液中，充分震荡溶解，配成10%的均匀分散的溶液或悬液。（2）含抗菌剂培养基配制：将已配成10%的抗（抑）菌溶液或悬液用PBS做对
7、倍系列稀释成不同浓度的受试液，置45C5（C水浴恒温备用。（3）双倍浓度培养基配制：称取76gMH琼脂培养基，溶于IooomI水中。加热至沸腾溶解。然后121压力蒸汽灭菌15min,置45C50C水浴备用。此培养基将用于稀释抗（抑）菌溶液或悬液。（4）含抗（抑）菌液培养基的配制：分别取IOml系列稀释的抗菌液加入平皿内。将在45C50C水浴中的双倍MH琼脂培养基IomI,加入平皿内，边加边摇晃平板，使抗（抑）菌液和培养基充分混匀，待凝固后备用。（5）用加样器取ll2l（含菌量约为1（TcfuZmD菌悬液点种于含抗（抑）菌液培养基的平皿，接种后所形成的菌液圈直径约5mm8mm（每个点菌量约为10
8、。CfU）O（6）以同样方法接种不含抗（抑）菌成分的MH琼脂平板，作为阳性对照。（7）将接种后的平板放置35C培养箱中，倒置培养18h24h,观察结果。3.4 评判规定菌落生长被完全抑制的最低抗（抑）菌液浓度为该样品对受试菌的MIC。单一菌落生长可忽略不计。3.5 注意事项（1）接种时，应由低抗（抑）菌剂浓度向高浓度平板依次接种，最后接种对照平板。（2）为了保证平板受热均匀，培养时平板堆放不得超过4个。4最小抑菌浓度测定试验（营养肉汤稀释法）4.1 原理本试验将不同浓度的抑菌剂混合溶解于营养肉汤培养基中，然后接种细菌，通过细菌的生长与否，确定抗（抑）菌剂抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度
9、（MinimallnhibitoryCOnCentratiOn,MIC）O本方法式用于可溶性抑菌产品。4.2 试验器材(1)试验菌株：金黄色箱萄球菌ATCC6538,大肠杆菌8099或ATCClI229。可根据抑菌剂的用途，选择特定的菌株。(2)营养肉汤培养基，见附录A。(3)稀释液，见附录A。(4)吸管、试管(5) 37培养箱。5.3 操作步骤(1)按2.1.1.2所示方法制备的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌悬液(2)含抗菌剂培养基配制：将抗(抑)菌溶液用蒸锚水做对倍系列稀释成不同浓度的受试液，取各稀释度受试液2.5ml加入到含2.5ml双倍浓度营养肉汤的试管中。(3)取0.1ml含菌量约为108
10、cfllml菌悬液接种于含抗(抑)菌剂的营养肉汤的试管中，作为试验组样本。(4)以同样方法接种不含抗(抑)菌剂的营养肉汤的试管中，作为阳性对照组样本。(5)取2支含营养肉汤的试管中，作为阴性对照组样本。(6)将试验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本放置37C培养箱中，培养48h,观察结果。(7)试验中应将试验用菌悬液进行活菌培养计数，其作用浓度应为5X105cfuml5Xl()6cfuml.5.4 评判规定当阳性对照管有细菌生长(混浊)，阴性对照管无菌生长(透明),试验用菌悬液的作用浓度为5X105cfllml5XIO6CfUymI时，试验组无菌生长的最高稀释度所对应的抗(抑)菌剂浓度，为
11、该样品对受试菌的MIC。5.5 注意事项接种时，应由低抗(抑)菌剂浓度向高浓度依次接种，5滞留抑菌效果试验5.6 原理本试验通过模拟适合细菌生长、繁殖和可能产生感染的皮肤条件下，使用随机性、双盲的、配对比较的方法检测抗(抑)菌香皂和抗菌沐浴露12h或24h的滞留抑菌效果。5.7 试验器材(1)试验产品：试验品为25套按顺序编号的香皂样品。每套2块，一块为测试样品皂，另一块为不含抑菌剂的对照皂。(2)不含抑菌剂的洗发水25瓶(200ml瓶)(3)不含抑菌剂的香皂25块(4)胰蛋白酶大豆肉汤培养基(TSB)(5)胰蛋白酶大豆琼脂培养基(TSA)(6) 0.075molL的磷酸盐缓冲液(7) 70%
12、酒精(8)恒温箱(9)金属筒(直径2.2cm、高度3cm)(10) 一次性接种环(直径4mm)(11)小塑料碗(直径2.2cm,高2.5mm,)(12)胶带(Darapore3M公司生产)(13)尼龙刮菌棒(U)Triton-X100500ml(15)外用抗生素软膏(例如:百多邦莫匹罗星软膏)(16)玻璃弯棒(17)羊血(18)金黄色葡萄球菌ATCC27217(此株金黄色葡萄球菌是一种低毒性、对青霉素敏感、对四环素有抗药性的色素株，曾用于许多试验研究，没有任何严重副作用）。（19）皮肤消毒剂(11) 验步骤（1）调整阶段试验开始前7d至14d,受试者使用不含抗（抑）菌成分的香皂、洗发水和沐浴液
13、进行日常的洗手、洗澡。此阶段持续至少7d,但不超过14d。（2）清洗阶段清洗阶段共3d,受试者每天用抑菌皂清洗一侧前臂，用对照皂清洗另一侧前臂，清洗过程如下：1）先清洗左臂，用流动水（水温应保持在35C37C）打湿前臂内侧；2）用香皂从手腕至臂肘上下摩擦15s；3）用手在涂有香皂的手臂上上下摩擦泡沫45s；4）用流动的清水冲洗前臂15s,不要搓擦；5）用纸巾沾干前臂.不要搓擦；6）重复以上步骤清洗右臂；7）按上面所描述的试验步骤每日清洗前臂3次，每次间隔至少一个小时，在最后一次清洗之后，需记录好时间，在I2h之后，进行滞留效果检测。在第9次清洗前臂以后，受试者不能洗澡、淋浴或洗净前臂，直到试验
14、结束。用品包的标签上注明洗哪只手臂。清洗前后的两块香皂的重量及受试者完成清洗的情况，须记录下来。（3）试验阶段清洗阶段的第四天（最后一次清洗后12h或24h）,将在受试者每只前臂上划出一个试验区，对试验区进行接种、封包和回收存活细菌，具体步骤如下：1）将金黄色葡萄球菌（ATCC27217）连续转种3代,取第3代培养物接种于胰蛋白大豆肉汤培养基（TSB）中，在35C2C的条件下培养20h2ho然后用胰蛋白醐大豆肉汤适当稀释菌悬液，使菌悬液浓度约为108cfuml109cfumlo2）细菌接种：在受试者的每只前臂中间部位（不要在手腕和肘皱褶处），用带有印墨直径为3.0Cm的玻璃量筒扣在皮肤上,划分
15、出一个试验区。使用加样器取10l上述菌悬液,接种于前臂试验区（菌落数为106cfu试验区l（）7cfu/试验区），用一次性接种环，把接种物涂成一圆形，使其与试验区边缘应有4mm5mm的距离。3）封包:细菌接种后立即用小塑料碗扣于染菌区上面，再用胶带将小塑料碗固定在皮肤上，记录封包的时间。4）回收存活细菌：接种后2h5min对前臂上接种的区域进行取样。将金属筒放置于试验区中间部位,不要接触到盖有印墨的边缘。将Iml含0.1%triton-X100的0.075molL磷酸盐缓冲液吸移至金属筒内，用尼龙刮菌棒刮洗金属筒罩住区域内的皮肤60s,将筒内液体吸移至试管内，再加ImI含0.1%trikmX-100的0.075molL磷酸盐缓冲液，对该区域内的皮肤进行第2次刮洗30s,将第2次擦洗的液体，注入含第1次刮洗液体的试管中。5）实验区试验后的消毒处理：一个实验区采样之后，需用70%的酒精对实验区进行消毒。然后对另一个实验区以同样方法进行采样，采样结束后，先用70%的酒精对实验区进行消毒，然后用皮肤消毒剂对两只前臂进行消毒处理，处理后清水冲洗，擦干，再涂少量的抗生素软膏。
