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1、 第四章第四章 原代细胞的培养和建系原代细胞的培养和建系n凡是来源于胚胎、组织器官及外周凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。初培养的细胞称之为原代细胞。n凡是经传代方式进行再次培养的细凡是经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。胞称为传代细胞。n若能稳定生长传至若能稳定生长传至10-20代以上的细代以上的细胞可确立为细胞系。胞可确立为细胞系。n单细胞经克隆、纯化并大量扩增所单细胞经克隆、纯化并大量扩增所形成的特性稳定的细胞群体称为细形成的特性稳定的细胞群体称为细胞株或克隆细胞。胞株或克隆细胞。第一节第一节 原代
2、细胞的取材原代细胞的取材n人和动物细胞的取材是原代细人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。影响细胞的体外培养。一、取材的基本要求一、取材的基本要求 1取材要注意新鲜和保鲜取材要注意新鲜和保鲜2应严格无菌应严格无菌3防止机械损伤防止机械损伤4去除无用组织和避免干燥去除无用组织和避免干燥5注意组织类型、分化程度、年龄等注意组织类型、分化程度、年龄等6作好记录作好记录n二、各类组织的取材技术二、各类组织的取材技术 n皮肤和粘膜的取材皮肤和粘膜的取材n内脏和实体瘤的取材内脏和实体瘤的取材n血液细胞的取材血液细胞的取材n骨髓、羊水、胸骨髓、羊水
3、、胸/腹水细胞取材腹水细胞取材n动物组织取材动物组织取材n人胚体组织取材人胚体组织取材n鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材n皮肤和粘膜的取材皮肤和粘膜的取材 n主要取自于手术过程中的皮片，方法主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积似外科取断层皮片手术操作，但面积一般一般24平方厘米。平方厘米。n内脏和实体瘤的取材内脏和实体瘤的取材 n内脏除消化道外基本是无菌的，但取内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部
4、富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。组织。n血液细胞的取材血液细胞的取材 n血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。细胞，取材时应注意抗凝。n骨髓、羊水、胸骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材腹水细胞取材 n严格无菌，注意抗凝，还要尽快分严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗洗两次，再用培养液洗一次后即可培两次，
5、再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。养，不宜低温存放。n动物组织取材动物组织取材 1、鼠胚组织取材、鼠胚组织取材 首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无四肢，切开
6、皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。2、幼鼠胚肾（或肺）取材、幼鼠胚肾（或肺）取材 幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取开至两侧：然后
7、采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，然后采用部毛皮切开游离并拉向两侧，然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。无菌法从背部打开腹腔取肾。n鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材步骤鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材步骤（1）取孵化至适当胚龄（）取孵化至适当胚龄（912天）的胚蛋，天）的胚蛋，暗处灯检，选取血管丰富、胚体有运动的胚暗处灯检，选取血管丰富、胚体有运动的胚蛋，用有色笔划出气室和胚体位置；蛋，用有色笔划出气室和胚体位置；（2）清洗蛋壳，再用碘酒、）清洗蛋壳，再用碘酒、75%酒精消毒；酒精消毒；（3）在无菌条件下采用无菌法用剪刀或中号）在无
8、菌条件下采用无菌法用剪刀或中号镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳；镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳；（4）用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚；）用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚；（5）用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入）用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入无菌平皿中，解剖取材。无菌平皿中，解剖取材。第二节第二节 原代细胞的分离和制作原代细胞的分离和制作n人或动物体内（或胚胎组织）由于人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，必须将胞在体外培养中生长繁殖，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解现有的组织块充分散开，使细胞解离出来。离出来。一
9、、悬浮细胞的分离方法一、悬浮细胞的分离方法 n组织材料若是来自血液、羊水、胸水组织材料若是来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用采用1000r/min的低速离心的低速离心10分钟。经分钟。经离心后由于各种细胞的比重不同可在离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。要收获目的细胞。二、实体组织材料的分离方法二、实体组织材料的分离方法n对于实体组织材料，由于细胞间结对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用
10、机械分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。分散法（物理裂解）和消化分离法。（一）机械分散法（一）机械分散法n n方法方法:n特点特点:简便、快速，简便、快速，但对组织机械但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差，适用损伤大，而且细胞分散效果差，适用于处理纤维成分少的软组织。于处理纤维成分少的软组织。（二）消化分离法（二）消化分离法 n组织消化法是把组织剪切成较小团块（或组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，
11、此时再采用团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。生长。n酶消化分离法酶消化分离法 n酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶酶n胰蛋白酶（胰蛋白酶（trypsin）分散原理：胰蛋）分散原理：胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸
12、或精氨酸介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开。质水解而使细胞分散开。n影响胰蛋白酶作用的主要因素影响胰蛋白酶作用的主要因素 n 细胞类型细胞类型n 酶的活力，活力通常在酶的活力，活力通常在1：200、56C、pH=8.0 左右时最强左右时最强n 酶的浓度酶的浓度n 温度温度n pHn 无机盐离子，钙、镁等有抑制作用无机盐离子，钙、镁等有抑制作用n 消化时间消化时间n胶原酶（胶原酶（collagenase）消化法）消化法 n胶原酶是一种从细菌中提取出来的胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适酶，
13、对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用化作用。消化分离法的操作步骤消化分离法的操作步骤：消化分离：消化分离法的操作步骤法的操作步骤n 剪切剪切n 加液漂洗加液漂洗n 消化消化n 弃去消化液弃去消化液n 漂洗漂洗n 机械分散机械分散n消化分离法的注意事项消化分离法的注意事项（1）组织块必须漂洗）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。的抑制作用。（2）胰蛋白酶浓度不宜过高，作用时间不）胰蛋白酶浓度
14、不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。能太长，以避免毒性作用。（3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失。免膨松的细胞随漂洗而丢失。三、原代细胞的培养方法三、原代细胞的培养方法 n原代细胞的培养也叫初代培养是从原代细胞的培养也叫初代培养是从供体取得组织细胞在体外进行的首供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。是一项基本技术。n原代细胞最接近和最能反映体内生原代细胞最接近和最能反映体内生长特性，适用于药物
15、敏感性试验、长特性，适用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。细胞分化等实验研究。（一）组织块培养法（一）组织块培养法 n组织块培养是常用、简便易行和成功组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法。率较高的原代培养方法。n基本方法是将剪成的小组织团块接种基本方法是将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。（二）消化培养法（二）消化培养法（三）悬浮细胞培养法（三）悬浮细胞培养法 n对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、对
16、于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。巴细胞分层液分离后接种培养。（四）器官培养（四）器官培养 n器官培养是指从供体取得器官或组织器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，的特定环境条件下培养，n器官培养可保持器官组织的相对完整器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。的生物调节作用。第三节第三节 原代和传代细胞的培养和维持原代和传代细胞的培养和维持n原代细胞的培养与维持原代细胞的培养与维持n原代细胞培养的首次传代原代细胞培养的首次传代n传代细胞的传代培养传代细胞的传代培养n传代细胞的建系和维持传代细胞的建系和维持一、原代细胞的培养与维持一、原代细胞的培养与维持（一）原
