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1、1生物技术及应用专业天然产物化学天然产物化学2 2实验实验 三三薄层板的制备及活化薄层板的制备及活化 硅胶板硅胶板 天然产物化学天然产物化学3薄层色谱简介薄层色谱简介薄层色谱中的吸附剂是铺在玻璃、塑料或薄层色谱中的吸附剂是铺在玻璃、塑料或金属片或薄板上的较薄的、均匀的一层细金属片或薄板上的较薄的、均匀的一层细粉状物质，因支持剂的种类、制备方法和粉状物质，因支持剂的种类、制备方法和选用溶剂的不同，可按吸附、分配或二者选用溶剂的不同，可按吸附、分配或二者结合的方式达到分离化合物的目的。结合的方式达到分离化合物的目的。TLC中涂布的物质如硅胶、氧化铝、聚酰中涂布的物质如硅胶、氧化铝、聚酰胺等。硅胶是
2、最常用的薄层色谱吸附剂。胺等。硅胶是最常用的薄层色谱吸附剂。天然产物化学天然产物化学4可以通过比较斑点的可以通过比较斑点的Rf值，或将未知值，或将未知样品与对照品在同一板上展开至同样样品与对照品在同一板上展开至同样高度，对样品进行初步的鉴定。高度，对样品进行初步的鉴定。还可通过比较可见斑点的大小进行半还可通过比较可见斑点的大小进行半定量的判断。定量的判断。还可以通过光密度测量法实现定量测还可以通过光密度测量法实现定量测定。定。天然产物化学天然产物化学5一、目的要求一、目的要求1掌握薄层板的制备及薄层层析的掌握薄层板的制备及薄层层析的操作方法；操作方法；2掌握吸附剂活度测定的原理及方掌握吸附剂活
3、度测定的原理及方法；法；3会应用薄层层析法检测识中草药会应用薄层层析法检测识中草药化学成分。化学成分。天然产物化学天然产物化学6二、薄层板的制备二、薄层板的制备1不加粘合剂的薄层涂布法不加粘合剂的薄层涂布法（1）氧化铝薄层）氧化铝薄层（2）纤维素薄层）纤维素薄层（3）聚酰胺薄层）聚酰胺薄层2加粘合剂薄层的涂布法加粘合剂薄层的涂布法（1）硅胶）硅胶G薄层薄层（2）硅胶（）硅胶（H）羧甲基纤维钠（）羧甲基纤维钠（CMC-Na）薄层薄层 天然产物化学天然产物化学7（1）氧化铝薄层）氧化铝薄层将吸附剂置于薄层涂布器中，调节涂布器的高度，将吸附剂置于薄层涂布器中，调节涂布器的高度，向前推动，即得均匀薄层
4、。向前推动，即得均匀薄层。本实验主要用下述简易操作涂布薄层，取表面光本实验主要用下述简易操作涂布薄层，取表面光滑，直径统一的玻璃一支，依据所制备薄层的宽滑，直径统一的玻璃一支，依据所制备薄层的宽度、厚度要求，在玻璃棒两端套上厚度为度、厚度要求，在玻璃棒两端套上厚度为0.31mm的塑料圈或金属环，并在玻璃棒一端一的塑料圈或金属环，并在玻璃棒一端一定距离处套上较厚的塑料圈或金属环，以使玻璃定距离处套上较厚的塑料圈或金属环，以使玻璃棒向前推动时能保持平行方向，操作时，将氧化棒向前推动时能保持平行方向，操作时，将氧化铝粉均均地铺在玻璃板上，匀速向前推动。铝粉均均地铺在玻璃板上，匀速向前推动。天然产物化
5、学天然产物化学8（2）纤维素薄层）纤维素薄层 一般取纤维素粉一般取纤维素粉1份加水约份加水约5份，在烧份，在烧杯中混合均匀后，倒在玻璃板上，轻杯中混合均匀后，倒在玻璃板上，轻轻振动，使涂布均匀，水平放置，待轻振动，使涂布均匀，水平放置，待水分蒸发至近干，于水分蒸发至近干，于1002干燥干燥3060分钟即得。分钟即得。天然产物化学天然产物化学9（3）聚酰胺薄层）聚酰胺薄层取锦纶丝经一系列加工使其完全溶解成透取锦纶丝经一系列加工使其完全溶解成透明胶状溶液。明胶状溶液。将此溶液适量倒在水平放置的洗净的玻璃将此溶液适量倒在水平放置的洗净的玻璃片上，并自然向周围推匀，厚度约片上，并自然向周围推匀，厚度约
6、0.3mm,薄层太厚时，干后会裂开。薄层太厚时，干后会裂开。完全固化后变不透明白色，再放数小时后，完全固化后变不透明白色，再放数小时后，泡在流水中洗去甲酸，先在空气中晾干，泡在流水中洗去甲酸，先在空气中晾干，后在烘箱中后在烘箱中0恒温加热活化恒温加热活化15分钟，冷后分钟，冷后置干燥器中贮存备用。置干燥器中贮存备用。天然产物化学天然产物化学10（1）硅胶）硅胶G薄层薄层取硅胶取硅胶G或硅胶或硅胶GF一份，置烧杯中加一份，置烧杯中加水约水约3份混合均匀（加水量根据实际情份混合均匀（加水量根据实际情况自行调整）况自行调整），放置片刻；，放置片刻；随即用药匙取一定量，分别倒在一定随即用药匙取一定量，
7、分别倒在一定大小的玻璃片上（或倒入涂布器中，大小的玻璃片上（或倒入涂布器中，推动涂布），均匀涂布成推动涂布），均匀涂布成0.250.5mm厚度，厚度，轻轻振动玻璃板，使薄层面平轻轻振动玻璃板，使薄层面平整均匀整均匀；天然产物化学天然产物化学11在水平位置放置，待薄层发白近干，在水平位置放置，待薄层发白近干，于烘箱中于烘箱中105活化活化0.51小时小时，冷后，冷后贮于干燥器内备用。贮于干燥器内备用。活化温度和时间可依需要调整，一般活化温度和时间可依需要调整，一般检识水溶性成分或一些极性大的成分检识水溶性成分或一些极性大的成分时，所用薄层板只在空气中自然干燥，时，所用薄层板只在空气中自然干燥，不
8、经活化即可贮存备用。不经活化即可贮存备用。天然产物化学天然产物化学12物质之所以能在吸附剂（物质之所以能在吸附剂（以硅胶、氧化铝以硅胶、氧化铝或正相键合硅胶为例或正相键合硅胶为例）的薄层上分离，是）的薄层上分离，是因为吸附剂的表面及其孔隙的表面存在许因为吸附剂的表面及其孔隙的表面存在许多活性点，被吸附物质（极性或可极化的多活性点，被吸附物质（极性或可极化的物质）的量及被吸附的牢固程度在其它条物质）的量及被吸附的牢固程度在其它条件一定的条件下取决于活性点的强度（单件一定的条件下取决于活性点的强度（单位面积的表面能量）及数目（单位质量的位面积的表面能量）及数目（单位质量的表面积），表面积），单位质
9、量吸附剂所含活性点的数目越多、单位质量吸附剂所含活性点的数目越多、活性点的强度越大，则吸附剂的活度越高，活性点的强度越大，则吸附剂的活度越高，即，对物质（极性或可极化的物质）的吸即，对物质（极性或可极化的物质）的吸附能力越强，被吸附物质的附能力越强，被吸附物质的Rf值就越小。值就越小。天然产物化学天然产物化学13当此类吸附剂的含水量增加时，吸附当此类吸附剂的含水量增加时，吸附剂的活性点被水中羟基占据的数目增剂的活性点被水中羟基占据的数目增多，因此，自由活性点减少，吸附剂多，因此，自由活性点减少，吸附剂的活度变小，吸附力也变小，于是被的活度变小，吸附力也变小，于是被吸附物质的吸附物质的Rf就变大
10、。就变大。因此因此,为了使薄层板的水分含量相对为了使薄层板的水分含量相对一致一致,使用对薄板进行活化可以使使用对薄板进行活化可以使Rf值具有较好的重现性。值具有较好的重现性。天然产物化学天然产物化学14（2）硅胶）硅胶(H)CMC-Na薄层薄层取羧甲基纤维素取羧甲基纤维素（CMC-Na）0.2g，溶，溶于于25ml水中，在水浴上加热搅拌使完水中，在水浴上加热搅拌使完全溶解，倒入烧杯中，加薄层层析用全溶解，倒入烧杯中，加薄层层析用硅胶（颗粒度硅胶（颗粒度1040m的约的约68g）。）。混成均匀的稀糊，按照硅胶混成均匀的稀糊，按照硅胶G薄层涂布薄层涂布法制备薄层法制备薄层;（轻摇均匀涂布）（轻摇均
11、匀涂布）天然产物化学天然产物化学15或取或取0.8%羧甲基纤维纳羧甲基纤维纳10ml，倒入广口，倒入广口瓶（高约瓶（高约1012cm）中，然后逐步加入薄）中，然后逐步加入薄层层析用硅胶层层析用硅胶3.3克，不断振摇成均匀的稀克，不断振摇成均匀的稀糊；糊；把两块载玻片面对面结合在一起，这样每把两块载玻片面对面结合在一起，这样每片只有一面与硅胶糊接触，使薄片浸入硅片只有一面与硅胶糊接触，使薄片浸入硅胶稀糊中，然后慢慢取出，分开二块薄片，胶稀糊中，然后慢慢取出，分开二块薄片，将未粘附硅胶糊的那一面水平放在一张清将未粘附硅胶糊的那一面水平放在一张清洁的纸上，让其自然阴干，洁的纸上，让其自然阴干，100
12、下烘下烘30分钟。冷后于干燥器内备用。未消耗的硅分钟。冷后于干燥器内备用。未消耗的硅胶稀糊可贮存在广口瓶内，以供再用。胶稀糊可贮存在广口瓶内，以供再用。天然产物化学天然产物化学16三、仪器和试剂三、仪器和试剂 玻璃板（玻璃板（510cm 或或 2.57.5cm，洁净，洁净且干燥）且干燥）薄层色谱用硅胶薄层色谱用硅胶H0.8%羧甲基纤维素钠水溶液羧甲基纤维素钠水溶液层析缸、点样毛细管层析缸、点样毛细管混合染料：含二甲黄、苏丹红、靛酚蓝各混合染料：含二甲黄、苏丹红、靛酚蓝各0.40mg/ml。展开剂：石油醚（。展开剂：石油醚（A.R.）或）或苯（苯（A.R.）天然产物化学天然产物化学17四、实验步
13、骤四、实验步骤把玻璃板清洗干净并烘干；把玻璃板清洗干净并烘干；取羧甲基纤维素取羧甲基纤维素（CMC-Na）0.2g，溶于溶于25ml水中，在水浴上加热搅拌使水中，在水浴上加热搅拌使完全溶解，完全溶解，在三角烧瓶中把一份硅胶在三角烧瓶中把一份硅胶H和三份和三份CMC-Na溶液（溶液（0.8%）混合，并用力）混合，并用力振摇至少振摇至少30秒。（混合均匀）秒。（混合均匀）天然产物化学天然产物化学18 将混合好的溶液倾倒在玻璃板上，将混合好的溶液倾倒在玻璃板上，轻轻振动，使轻轻振动，使涂布均匀涂布均匀，水平放置，水平放置。铺好的板静置铺好的板静置5分钟，然后把它们面分钟，然后把它们面朝上移至一个朝上
14、移至一个水平的平面上水平的平面上，阴干。，阴干。把阴干后的板在把阴干后的板在105的烘箱中烘的烘箱中烘30分钟。分钟。活化。活化。待板凉至室温后，置干燥器中保存待板凉至室温后，置干燥器中保存 天然产物化学天然产物化学19关于配制关于配制CMC-Na：先将称好的先将称好的CMC-Na加入所需水量的加入所需水量的8/10，让，让其充其充分溶涨后分溶涨后,再加热煮沸再加热煮沸,然后将剩余水慢慢加入然后将剩余水慢慢加入.这样这样在煮沸过程中不易形成颗粒在煮沸过程中不易形成颗粒,煮沸时间短煮沸时间短.溶液的浓度溶液的浓度0.3-0.8%比较合适，实际操作中比较合适，实际操作中0.40.5最为实用，最为实
15、用，浓度高浓度高：将来显色时如有加热过程板子容易发黑将来显色时如有加热过程板子容易发黑；浓度低浓度低：铺的板子不结实，铺的板子不结实，易易掉渣，不掉渣，不易易保存，点保存，点样时易出洞样时易出洞。天然产物化学天然产物化学20五、硅胶活度的测定五、硅胶活度的测定 一般选用三种染料的薄层层析法进行一般选用三种染料的薄层层析法进行测定。测定。欧洲药典欧洲药典1969年记载用年记载用0.01%二甲基二甲基黄、苏丹红、靛酚蓝的苯溶液各黄、苏丹红、靛酚蓝的苯溶液各10l点滴于硅胶点滴于硅胶G或硅胶或硅胶H薄层上，薄层上，以苯为以苯为展开剂展开剂，展开，展开10cm（约（约20分钟），三分钟），三种染料应明
16、显分离；种染料应明显分离；天然产物化学天然产物化学21 点样与展开：取薄层板一块，在距点样与展开：取薄层板一块，在距板的一端板的一端2cm处用铅笔轻轻划上起处用铅笔轻轻划上起始线并在距起始线始线并在距起始线10cm处划出前沿处划出前沿线。线。在起始线上划上在起始线上划上2-3个点样点，每点个点样点，每点间隔间隔2cm，两侧点距边缘，两侧点距边缘2cm。用内径约用内径约1mm的平口毛细管轻轻点的平口毛细管轻轻点上混合染料溶液，边点边用冷风吹，上混合染料溶液，边点边用冷风吹，原点直径应不超过原点直径应不超过23mm。天然产物化学天然产物化学22 挥干溶剂，将薄层板置于放有苯的挥干溶剂，将薄层板置于放有苯的层析缸中，展开至前沿线时，取出，层析缸中，展开至前沿线时，取出，挥干溶剂，划出实际前沿线。挥干溶剂，划出实际前沿线。观察斑点的位置，测量计算出二甲观察斑点的位置，测量计算出二甲黄、苏丹红、靛酚蓝的黄、苏丹红、靛酚蓝的Rf值，判断值，判断活度。活度。（相关活度级别可查询有关资料）（相关活度级别可查询有关资料）天然产物化学天然产物化学23苯展开则应分成三个斑点，合格的硅胶粘苯展开则应分成三个斑
