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1、三、三、微生物突变的应用：微生物突变的应用：自发突变育种自发突变育种 生产育种生产育种:选育正向突变的优良的品种选育正向突变的优良的品种 定向培育定向培育(卡介苗卡介苗BCG):BCG):积累并选择相应的自发突变株积累并选择相应的自发突变株诱变育种诱变育种 用物理（用物理（X-rayX-ray、UVUV等）化学（吖啶、亚硝酸、等）化学（吖啶、亚硝酸、碱基类似物）因素诱变育种，获得突变机率提高。碱基类似物）因素诱变育种，获得突变机率提高。Ames testAmes test：对化学诱变剂做检测：对化学诱变剂做检测菌种：菌种：鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌his-；原理：原理：his-在基本培养基上
2、不在基本培养基上不长；而发生回复突变则长。长；而发生回复突变则长。Ames test Ames test 方法示意图方法示意图第三节第三节 基因重组基因重组定义：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一定义：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（体的方式，称为基因重组（gene recombination）或）或遗传重组。遗传重组。重组与杂交的关系：重组与杂交的关系：重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂
3、交平上的杂交而一般所说的杂交（而一般所说的杂交（hybridization）则是细胞水平上的一个概念。）则是细胞水平上的一个概念。作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。产生新遗传型的个体。基因重组的意义基因重组是杂交育种的理论基础。基因重组是杂交育种的理论基础。杂交育种的优点：杂交育种的优点：由于杂交育种选用了已知性状的供体菌由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，和受体菌作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。均比诱变育种前进了一大步。利用杂交
4、育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，它是一种重要的育种手段。的育种手段。杂交育种的缺点：杂交育种的缺点：由于杂交育种的方法较复杂，工作进展较由于杂交育种的方法较复杂，工作进展较慢，还很难像诱变育种技术那样得到普遍的推广和使用，慢，还很难像诱变育种技术那样得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多技术来培育可应用于生产实践上的
5、高产菌株的例子还不多见。到了见。到了70年代后期，由于原生质体融合技术获得巨大的年代后期，由于原生质体融合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。甲甲生长快、产量低生长快、产量低乙乙生长慢、产量高生长慢、产量高基因重组基因重组如：如：生长快、产量高生长快、产量高一、原核微生物的基因重组基因重组的方式：基因重组的方式：转化转化转导转导接合接合原生质体融合原生质体融合 R型活菌型活菌+S型死菌型死菌 S型活菌型活菌定义：定义：受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体菌的受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体菌的游离游离DNA片段，
6、并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。转化后的的受体菌称为的遗传性状的基因转移过程，称为转化。转化后的的受体菌称为转化子（转化子（transformant）。）。（一）转化（一）转化（transformation）1、转化及其发现：、转化及其发现：有关名词：有关名词：受体菌：受体菌：转化基因的接受者转化基因的接受者供体菌：供体菌：转化基因的提供者转化基因的提供者转化因子：转化因子：来自供体菌的来自供体菌的DNA片段片段转化子转化子：将转化基因重组进入自身染色体组的重组子：将转化基因重组进入自身染色体组的重组子
7、受体细胞要处于感受态受体细胞要处于感受态.感受态感受态：受体细胞能从环境吸取外源：受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态；片段并实现其转化的一种生理状态；供体供体DNA片段大小适宜，分子量一般片段大小适宜，分子量一般为为1 107 D 左右左右 ；菌株间的亲缘关系密切。菌株间的亲缘关系密切。2、转化发生的条件：、转化发生的条件：感受态：感受态：出现时间：出现时间：只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态出现在不同生长时期出现在不同生长时期Streptococcus pneumoniae的感受态出现在生长曲线中的指数期的中期，
8、的感受态出现在生长曲线中的指数期的中期，Bacillus的一些种则往往出现在指数期末及稳定期的初期。的一些种则往往出现在指数期末及稳定期的初期。感受态细胞的比例：感受态细胞的比例：当处于感受态高峰时，群体中呈感受态的当处于感受态高峰时，群体中呈感受态的细胞因菌种而不同细胞因菌种而不同.Bacillus subtilis不超过不超过1015%Streptococcus pneumonia和和Haemophilus influenzae（流感嗜血杆菌）（流感嗜血杆菌）达到达到100%转化转化DNA的最低浓度：的最低浓度：在群体中含有在群体中含有15%感受态细胞时，感受态细胞时，0.1 gDNA/m
9、l细胞悬液即可有效发生转化细胞悬液即可有效发生转化感 受 态 因 子：感 受 态 因 子：细 胞 外 蛋 白，细 胞 外 蛋 白，S t re p t o c o c c u s p n e u m o n i a 和和 B a c i l l u s 中 分 离 的 分 子 量 为中 分 离 的 分 子 量 为5,00010,000Dalton，可能存在于细胞膜上，可催化，可能存在于细胞膜上，可催化外来外来DNA分子的吸收或降解细胞表面某种成分，以分子的吸收或降解细胞表面某种成分，以让细胞表面的让细胞表面的DNA受体显露出来；也可能是一种自受体显露出来；也可能是一种自溶酶。对不同细菌，每个细
10、胞上的溶酶。对不同细菌，每个细胞上的DNA结合位点数结合位点数不同。有人计算，在不同。有人计算，在H.Influenzae上有上有410个，而在个，而在S.Pneumonia上则有上则有3080个。个。S.Pneumonia的感受的感受态细胞中提取的感受态因子可使同菌株的非感受态态细胞中提取的感受态因子可使同菌株的非感受态细胞变成感受态的，而细胞变成感受态的，而Bacillus subtilis的感受态因子的感受态因子则无此功能。则无此功能。转化因子：转化因子：转化因子：本质是供体转化因子：本质是供体DNA片段片段一般的转化因子都是线状双链一般的转化因子都是线状双链DNA；也有少数报道认为；也
11、有少数报道认为线状单链线状单链DNA也有转化作用。也有转化作用。大小：经过多次提纯操作后，每一转化大小：经过多次提纯操作后，每一转化DNA片段的分子片段的分子量都小于量都小于1107，即约占细菌核染色体组的，即约占细菌核染色体组的0.3%，其，其上平均约含上平均约含15个基因。而粗制的个基因。而粗制的DNA则分子量较大。则分子量较大。吸收数量：每个感受态细胞约可掺入吸收数量：每个感受态细胞约可掺入10个转化因子。个转化因子。转化频率：转化频率：一般只有一般只有0.11%，最高时亦达，最高时亦达10%左右。左右。据研究，呈质粒形式据研究，呈质粒形式（双链闭合环状）的转化因子，其转的转化因子，其转
12、化频率最高（因为它进入受体菌中后，可不必与受体化频率最高（因为它进入受体菌中后，可不必与受体染色体进行交换、整合即可进行复制和表达）；。染色体进行交换、整合即可进行复制和表达）；。3、转化的类型：、转化的类型：根据感受态建立的方式，可以分为：自然遗传转化自然遗传转化人工转化人工转化自然转化自然转化到目前为止，已发现能发生转化作用的菌属主要有：到目前为止，已发现能发生转化作用的菌属主要有：Streptococcus pneumoniae、Haemophilus（嗜血杆菌属）、（嗜血杆菌属）、Bacillus、Neisseria（奈瑟氏球菌属）、（奈瑟氏球菌属）、Rhizobium（根瘤菌属）、（
13、根瘤菌属）、Staphylococcus、Pseudomonas和和Xanthomonas中多见。中多见。在若干放线菌和蓝细菌以及粗糙脉胞菌中，也有转化现象。在若干放线菌和蓝细菌以及粗糙脉胞菌中，也有转化现象。肠杆菌科的一些细菌很难进行转化，主要原因一方面由肠杆菌科的一些细菌很难进行转化，主要原因一方面由于外来于外来DNA难以掺入到细胞中，另一方面在受体细胞内常存难以掺入到细胞中，另一方面在受体细胞内常存在可降解线形在可降解线形DNA的核酸酶。如果用的核酸酶。如果用CaCl2处理处理E.coli的球状的球状体，就可以使之发生低频率的转化。另外，可利用霉菌的原体，就可以使之发生低频率的转化。另外
14、，可利用霉菌的原生质体进行转化。生质体进行转化。.转化的过程转化的过程以以S.Pneumonia strr（肺炎链球菌抗链霉素菌株）为例，大致（肺炎链球菌抗链霉素菌株）为例，大致可分为六阶段：可分为六阶段：吸附吸附：双链：双链DNA片段与细胞表面的特定位点结合，此时，细胞膜上的片段与细胞表面的特定位点结合，此时，细胞膜上的胆碱可促进这一过程。胆碱可促进这一过程。切割切割：在吸附位点上的：在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量为被核酸内切酶分解，形成平均分子量为45106的的DNA片段；片段；入胞入胞：DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单双链中的一条单链被膜上的
15、另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于5105的的DNA片段不能进入细胞。这时如用低浓度溶菌酶处理，因它提高了细胞片段不能进入细胞。这时如用低浓度溶菌酶处理，因它提高了细胞壁的通透性，故可提高转化频率；壁的通透性，故可提高转化频率；重组重组：来自供体菌的单链：来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，交换、整合和取代，于是形成了一个杂合的同源区配对，交换、整合和取代，于是形成了一个杂合DNA区段。区段。在这一过程中，有核酸酶、在这一过程中，有核酸酶、DN
16、A聚合酶和聚合酶和DNA连接酶的参与；连接酶的参与；复制复制：受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一：受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因；获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因；转化子形成转化子形成：当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转：当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。化子；另一个细胞与原始受体菌一样。降解降解吸附吸附切割成切割成45106单链入胞单链入胞同源部同源部分配对、分配对、整合整合复制分裂，只复制分裂，只有一个子代有一个子代DNA分子获得分子获得供体基因供体基因非转化子非转化子转化子转化子转化的过程转化的过程strrstrr人工转化人工转化人工转化人工转化是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人工地将的能力，或人工地将DNA导入细胞内。导入细胞内。方法：方法：CaCl2处理处理细胞，使其成为能摄取外源细胞，使其成为能摄取外源DNA的感受态状态的感受态状态.电穿孔法电穿孔法electro
