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1、标记抗体技术标记抗体技术标记抗体技术是应用最为广泛的免疫血清学技标记抗体技术是应用最为广泛的免疫血清学技术，主要有以下术，主要有以下3 3大类。大类。v免疫荧光抗体技术免疫荧光抗体技术v免疫酶技术免疫酶技术v放射免疫分析放射免疫分析标记抗体标记抗体v为什么要进行标记抗体？为什么要进行标记抗体？v什么是二抗？什么是二抗？免疫酶标记技术v酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISAELISA）v免疫酶组织化学染色技术免疫酶组织化学染色技术v斑点斑点-酶联免疫吸
2、附试验酶联免疫吸附试验一一 原理原理v酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建立的起来的免和酶催化反应的高敏感性而建立的起来的免疫检测技术。疫检测技术。v免疫酶相关的免疫制备技术免疫酶相关的免疫制备技术抗体的制备抗体的制备标记用酶标记用酶抗体标记抗体标记vELISA：间接法，直接法，夹心法，竞争法间接法，直接法，夹心法，竞争法v免疫组化免疫组化vDot-ELISA免疫酶相关的免疫制备技术免疫酶相关的免疫制备技术免疫酶相关的免疫制备技术免疫酶相关的免疫制备技术v制备结合物时所用制备结合物时所用纯度较高的纯度较高的IgGIgG，以免在与
3、酶联，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。结时其他杂蛋白的干扰。v最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。结果本底浅淡。v在在ELISAELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗抗原必须是高纯度的原必须是高纯度的。Preparation of Polyclonal AntibodiesvPolyclonal antiserum is generated in animals(sheep,rabbits or g
4、oats)with the introduction of antigens into the animals bloodstream.vThe antiserum(serum from blood containing the desired antibodies)contains a mixture of antibodies,each of which may bind to different antigen binding sites(epitopes).vAntiserum contains a mixture of antibodies.vThis mixture of anti
5、bodies are called ployclonal antibodies.vAn antigen that has multiple sites for antibody binding is called a mutivalent antigen.Preparation of Monoclonal AntibodiesvMonoclonal antibodies are highly specific for a single epitope on a multivalent antigen.vThey are produced from a single cell line usin
6、g hybridoma technology and mouse myeloma cell lines.抗体纯化抗体纯化v沉淀法沉淀法硫酸铵盐析硫酸铵盐析辛酸法辛酸法v层析法层析法凝胶过滤层析凝胶过滤层析离子交换层析离子交换层析免疫亲和层析免疫亲和层析硫酸铵盐析v取取10 ml10 ml血清加血清加10 ml10 ml生理盐水，加生理盐水，加入入20 ml20 ml饱和硫酸铵，终浓度为饱和硫酸铵，终浓度为50%50%。44，3h3h以上，使其充分沉淀。以上，使其充分沉淀。v离心弃上清，以离心弃上清，以10 ml10 ml生理盐水溶解生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵2
7、0ml20ml。置置43h43h以上以上.v重复上述第二步过程重复上述第二步过程1 12 2次。次。v末次离心后所得沉淀物为末次离心后所得沉淀物为-球蛋白，球蛋白，以以PBSPBS溶解至溶解至10ml10ml装入透析袋。装入透析袋。v对对PBSPBS充分透析、换液充分透析、换液3 3次，至萘氏次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无试剂测透析外液无黄色，即无NHNH4 4+为止为止例：兔抗鸭IgG的提纯(辛酸硫酸铵沉淀法)沉淀溶解透析离心，取上清加辛酸分离鸭血清上清透析过夜加饱和硫酸铵44静置10h10h离心，取沉淀取出分装SDSSDSPAGEPAGE检测v实验结果 提纯的兔抗鸭IgG的SDS-P
8、AGE M：蛋白Marker 1：提纯的兔抗鸭IgG 2:兔血清v凝胶过滤层析凝胶过滤层析主要是根据主要是根据蛋白质蛋白质的的大小和形状，即蛋白大小和形状，即蛋白质的质量进行质的质量进行分离分离和和纯化。纯化。层析柱层析柱中的填中的填料是某些惰性的多孔料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是网状结构物质，多是交联的聚糖交联的聚糖(如葡聚糖如葡聚糖或琼脂糖或琼脂糖)类物质，使类物质，使蛋白质混合物中的物蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同质按分子大小的不同进行分离。进行分离。离子交换层析离子交换层析v是以离子交换剂为固定是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平
9、分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方进行分离的一种层析方法。法。免疫的亲和层析免疫的亲和层析v将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中v那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。免疫酶相关的免疫制备技术免疫酶相关的免疫制备技术用于标记的酶用于标记的酶v辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（h
10、orseradish peroxidase,HRP）v碱性磷酸酶碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）v葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（glucose-oxidase，GO）三、抗体的酶标记v过碘酸钠氧化法过碘酸钠氧化法v戊二醛法戊二醛法过碘酸钠法vHRPHRP是一种糖蛋白，过碘酸钠可将是一种糖蛋白，过碘酸钠可将与酶活性无与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基关的多糖羟基氧化为醛基。v此醛基很活泼，再与抗体蛋白的游离氨基结此醛基很活泼，再与抗体蛋白的游离氨基结合，形成合，形成HRPHRPCH2CH2NHNHIgGIgG。v酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠酶与抗体的结合反应后，再加
11、入硼氢化钠(NaHB4)(NaHB4)还原后，即生成稳定的酶标记物。还原后，即生成稳定的酶标记物。过碘酸盐氧化法过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2抗体OOONN抗体抗体H2ON抗体NaBH4Schiff碱酶-五炭糖环戊二醛交联标记法v戊二醛它具有两个活性醛基，可分别与酶分戊二醛它具有两个活性醛基，可分别与酶分子和抗体子和抗体(抗原抗原)分子上的氨基结合。分子上的氨基结合。v分为一步法和二步法：分为一步法和二步法：HRP一步法一步法v将抗体将抗体(抗原抗原)、酶和戊二醛同时混合。、酶和戊二醛同时混合。HRPHRP、APAP与抗体与抗体(抗原抗原)的交联。的交联。v但
12、酶标记物的产率低，由于结合物立体构型但酶标记物的产率低，由于结合物立体构型障碍，酶和抗体容易失活；障碍，酶和抗体容易失活；v酶和抗体易发生自身交联，影响标记效果。酶和抗体易发生自身交联，影响标记效果。二步法二步法v先将过量的戊二醛与酶反应，让酶分子上的氨基仅先将过量的戊二醛与酶反应，让酶分子上的氨基仅与戊二醛分子上的醛基结合，不发生酶与酶的结合与戊二醛分子上的醛基结合，不发生酶与酶的结合v除去未与酶结合的多余戊二醛后除去未与酶结合的多余戊二醛后v再加入抗体再加入抗体(抗原抗原)，形成酶，形成酶戊二醛戊二醛抗体抗体(抗原抗原)结合物。结合物。v其优点是酶标记物均一，无自身聚合，分子量小易其优点是
13、酶标记物均一，无自身聚合，分子量小易穿透细胞膜，灵敏度与活性均较高，但其产率更低。穿透细胞膜，灵敏度与活性均较高，但其产率更低。戊二醛交联法（二步法）戊二醛交联法（二步法）COH-（CH2）3-COH +NH2-酶酶抗体抗体-NH2 +CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶酶抗体抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-酶酶ELISAv免疫酶技术(enzyme immunoassay)：是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。v酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验ELISAELISA（e
14、nzyme linked immunosorbent assayenzyme linked immunosorbent assay）是一类常用的免疫酶技术。是将已知是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。抗原抗体反应在固相表面进行。常用的酶：辣根过氧化物酶常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（APAP）。）。常见的酶联免疫吸附试验常见的酶联免疫吸附试验v直接法直接法v间接法间接法v双夹心法双夹心法v竞争法竞争法间接间接ELISAELISA检测抗体检测抗体检测对象检测对象ELIS
15、A的一般步骤（以间接的一般步骤（以间接ELISA为例）为例）二抗二抗包被抗原包被抗原一抗：一抗：待测血清待测血清底物液底物液洗涤洗涤封闭封闭洗涤洗涤洗涤洗涤终止终止结果结果判定判定操作步骤及步骤操作步骤及步骤包被：包被：抗原非特异地吸附在抗原非特异地吸附在ELISA板上板上 次日，用洗板液洗板3次（将洗板液加入每孔，1min后倾去），以洗去未包被的游离抗原。抗原用包被缓冲液稀释抗原用包被缓冲液稀释100ul/孔孔湿盒中，4过夜酶标板酶标板包被用缓冲液包被用缓冲液pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液ELISA板（条）板（条）包被用抗原的种类包被用抗原的种类v包被抗原的选择是间接包被抗原的选择是间接
16、ELISA方法建立的关方法建立的关键。键。v常用的包被抗原：常用的包被抗原：克隆表达及纯化的蛋白克隆表达及纯化的蛋白全微生物：病毒和细菌全微生物：病毒和细菌纯化的微生物组分：荚膜多糖、天然蛋白纯化的微生物组分：荚膜多糖、天然蛋白经过载体偶联的小分子半抗原经过载体偶联的小分子半抗原克隆表达及纯化的蛋白克隆表达及纯化的蛋白v选择合适靶点蛋白的可选择合适靶点蛋白的可以鉴别强毒与弱毒的感以鉴别强毒与弱毒的感染，以及感染与免疫引染，以及感染与免疫引起的抗体。起的抗体。v缺点：筛选合适的靶点缺点：筛选合适的靶点基因困难。基因困难。全微生物抗原：病毒和细菌全微生物抗原：病毒和细菌v包被前，均需要灭活处理。包被前，均需要灭活处理。v病毒个体较小，可以直接包被。病毒个体较小，可以直接包被。v细菌个体较大，包被前需要对细菌个体较大，包被前需要对ELISAELISA板进行致敏，板进行致敏，如利用戊二醛。如利用戊二醛。v缺点是抗原成分比较复杂，交叉反应多。缺点是抗原成分比较复杂，交叉反应多。纯化的微生物组分：荚膜多糖、天然蛋白纯化的微生物组分：荚膜多糖、天然蛋白v缺点：荚膜多糖的提纯步骤多，难以质控。天然蛋白
