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1、2023基于血液肿瘤突变负荷检测的现状与挑战摘要基于血液的肿瘤突变负荷检测(bTMB)是指通过二代测序技术分析循环肿瘤DNA中的突变数量，被认为是一种无创的免疫治疗标志物。bTMB与肿瘤免疫治疗的客观缓解率相关，但在长期预后获益中的预测价值有限。bTMB检测受到循环肿瘤DNA突变丰度、肿瘤异质性等多种因素的影响，校正干扰因素后的bTMB改进算法能更好地预测免疫治疗的长期生存获益。bTMB在临床应用过程中仍需克服方法学、经济学以及标准化层面的挑战。肿瘤突变负荷(tumormutationalburden,TMB)是指肿瘤基因组内存在的体细胞突变位点数量，通常以每百万碱基的突变个数(mut/Mb)
2、为单位进行描述1LTMB被认为是肿瘤免疫治疗疗效的预测性标志物。理论上，TMB越高则肿瘤产生的新抗原越多，更容易被免疫细胞识别，从而发挥抗肿瘤作用2,3,41研究显示，全外显子测序(wholeeomesequencing,WES)检出高TMB的恶性黑色素瘤患者，接受细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxicT-lymphocyte-associatedprotein4,CTLA-4)抗体免疫治疗的效果更好5o随后，在多项非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)的研究中,均得到了类似的结果6,71TMB作为免疫治疗疗效的生物标志物也被写入国家综合癌症网络
3、发布的非小细胞肺癌指南8oTMB与免疫治疗疗效的关系在多种实体瘤中都陆续得到了证实9,10o2020年，美国食品药品监督管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)批准采用FoundationOneCDx试剂盒检测TMB,以10mut/Mb作为临界值，用于指导帕博利珠单抗在实体瘤中的应用。最初对于TMB的研究都是基于组织样本，即组织TMB(tissuetumormutationalburden,tTMB),然而很多患者并不能提供足够合格的组织用于检测。约40%的组织样本因DNA质量不合格无法进行TMB检测6,11L因此，研究人员开始探索基于血液的生物标志物在免疫治疗中的
4、潜在价值。随着二代测序(next-generationsequencing,NGS)及液体活检技术的发展，越来越多的证据表明循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA,CtDNA)检测在肿瘤用药指导、疗效检测及预后预测等方面都展现出良好的应用前景12L基于血液的肿瘤突变负荷检测(blood-basedtumormutationalburden,bTMB),也就是检测CtDNA中的肿瘤突变数量，被认为是一种无创的免疫治疗标志物13o本文将回顾bTMB相关的临床研究进展，介绍bTMB检测的影响因素及算法优化，探讨bTMB临床应用中面临的挑战。-、bTMB能否替代tTMB用于免疫治疗的疗
5、效预测这里需要回答两个问题L是bTMB与tTMB的一致性如何？二是bTMB能否有效预测免疫治疗的疗效？研究显示，若直接比较同一肿瘤的bTMB与tTMB两者的一致性较差,bTMB值通常高于相应tTMB的测量值13,14o多种因素可能造成了这种差异。首先,bTMB与tTMB的算法不同。举例来说，在肺癌研究中，tTMB纳入突变丰度(allelefraction,AF)5%的单核昔酸变异和插入缺失,而bTMB仅纳入AF0.5%的单核昔酸变异13JO其次，不同生物样本之间存在的肿瘤异质性，tTMB仅反映单个活检样本的突变特征，而bTMB反映的是全体肿瘤释放入血的DNA突变特征。此外，肿瘤负荷也会影响一致
6、性。研究发现，肿瘤负荷较高的晚期肿瘤中，bTMB与tTMB的一致性更高15o值得注意的是，虽然TMB是一个连续数值变量,但在临床应用过程中一般划分为高TMB与低TMBo为了使bTMB与tTMB在预测免疫疗效时具有等效性，通常以tTMB为金标准选择最匹配的bTMB截断值。有研究显示采用靶向1100OoobP基因组编码序列区域的NGS检测组合对肺癌患者进行TMB检测，当tTMB的截断值设定为16mut/Mb时，bTMB相对应的截断值为42mut/Mb此时bTMB识别高TMB患者的阳性预测值达到95%150除了bTMB与tTMB检测一致性的问题，人们更关注的是bTMB能否有效预测肿瘤免疫治疗的疗效。
7、肺癌中的研究数据揭示了bTMB与NSCLC患者免疫治疗的疗效相关13随后开展的B-FlRST研究前瞻性地评估了bTMB作为NSCLC免疫治疗疗效预测标志物的价值16o研究显示，在接受一线阿特珠单抗单药免疫治疗的晚期NSCLC患者中，bTMB16与较高的客观缓解率相关(35.7%比5.5%,P14.5mutMbo在2020年发表的一项研究中，bTMB20mut/Mb的NSCLC患者接受免疫治疗的效果优于化疗。值得注意的是，该研究不仅佐证了bTMB在免疫治疗疗效预测中的价值,同时也验证了bTMB相比tTMB具备更高的检测成功率。该研究中血液样本比组织样本更容易获得(1001比735例)，bTMB的
8、成功检测率(809/1001,81%)远高于tTMB(460/735,63%)H=二、bTMB检测方法及影响因素目前，WES被认为是tTMB检测的金标准180随着NGS技术不断改进，基因组覆盖范围较大(800000bp)的NGS靶向测序也陆续被用于评估tTMB基于CtDNA的bTMB检测对于测序深度的要求远高于组织测序，相比于WES策略，降低基因组覆盖范围的靶向NGS测序在bTMB检测中更为常用。目前，仅少数获得临床验证的NGSpanel可用于bTMB检测,例如GuardantHealthGuardantOMNI及FoundationOneLiquidCDx19,20L不同检测方法的差别主要在
9、于在测序覆盖范围、测序深度以及生信分析策略，这些都是造成TMB检测结果差异的影响因素21除此之外，不同于tTMB检测，bTMB分析的准确性还受到CtDNA突变丰度、肿瘤异质性高低等因素的影响。研究表明，CtDNA高水平患者的预后往往较差22,23o最大体细胞变异丰度(maximumsomaticallelefrequency,MSAF)是反映CtDNA水平的指标之一,被证实会干扰bTMB预测免疫治疗疗效的准确慎24理论上，bTMB高的肿瘤患者接受免疫治疗的效果更好。然而，高bTMB患者中MSAF水平也更高，MSAF越高则预后较差。因此，MSAF对预后的影响导致bTMB无法准确预测免疫治疗的疗效
10、。值得注意的是，CtDNA丰度对bTMB检测的影响是复杂的Il既往研究显示,肿瘤突变丰度(allelefrequency,AF)低于1%的情况下,CtDNA与组织检测的一致性较差，且阳性预测值(positivepercentageagreement,PPA)较低250已有研究表明，肿瘤负荷影响bTMB检测的PPA15,平均AF0.1%相比于AF0.1%的患者中，bTMB与tTMB检测结果的相关性更高R20.32tt0.096、该研究还发现,bTMB在整体人群中达到的PPA为30%但在IV期肿瘤患者中PPA升高至63%上述结果均表明，肿瘤负荷较高(即平均AF较高或肿瘤分期较晚)的患者中，bTMB
11、与tTMB的相关性更高。但上述研究仅仅从bTMB与tTMB检测一致性的角度分析了CtDNA丰度带来的影响，并没有分析TMB在疗效预测方面是否受到CtDNA丰度的影响。除了CtDNA突变负荷对bTMB检测造成的偏倚，另一个重要的影响因素是肿瘤异质性260等位基因频率异质性反映了肿瘤异质性的程度,是指AF与MSAF的比值AF/MSAF10%代表存在肿瘤异质慎27o研究显示高TMB(16将肿瘤异质性存在显著相关曲68.6%比24.8%);此外，存在肿瘤异质性的NSCLC患者，总体生存期(overallsurvival,OS)更差(HR=I.52,95%Q1.271.83,P0.001)27o除了等位
12、基因频率异质性，其他方法也被用于评估CtDNA的肿瘤异质性程度,包括PyClone、THl狙28,29o将这些反映肿瘤异质性的参数与bTMB整合，或许能减少偏倚，从而更准确地预测免疫治疗给患者带来的获益。三、bTMB算法改进虽然bTMB与免疫治疗疗效相关，但bTMB并不能很好地预测患者的长期生存获益11,13,24,30,31o研究显示，经过36.5个月的中位随访时间，bTMB不能预测NSCLC患者接受免疫治疗后的总生存期及无进展生存期16JO上文讨论了影响bTMB评估的因素,CtDNA突变丰度与肿瘤异质性程度都会干扰bTMB的预测价值。因此，学者们陆续提出了多种bTMB的改进算法，旨在更好地
13、预测患者接受免疫治疗的疗效及预后24,30,321为了降低MSAF对bTMB的干扰，Wang等24开发了低等位基因-血液肿瘤突变负荷(lowallelefrequency-bTMB,LAF-bTMB)算法，仅选择AFW5%的位点纳入bTMB计算，结果显示LAF-bTMB与NSCLC患者免疫治疗的客观缓解率及预后显著相关,LAF-bTMB12患者接受免疫治疗的总生存期显著优于化疗组。随后，团队又开发了Ma-bTMB算法32,BPMa-bTMB=bTMB/(MSAF101在多个肺癌队列中进行验证,结果显示高Ma-bTMB可有效预测免疫治疗后的生存获益，即使在程序性死亡配体-1(programmed
14、deathligand1,PD-L1)表达阴性的患者中，高Ma-bTMB人群仍能从免疫治疗中取得长期生存获益。不同于前两个算法，近期发表的一项研究中，同时考虑了循环游离DNA(circulatingfreeDNA,cfDNA)投入量与突变丰度的影响,开发了ctDNA-adjustedbTMB算法30,即ctDNA-adjustedbTMB=bTMB/(CfDNA投入量X平均AFX该研究同样在多个肺癌队列中证实了ctDNA-adjustedbTMB能够有效预测接受免疫治疗的生存获益。通过校正干扰因素得到的bTMB改进算法,不仅能预测免疫治疗的客观缓解率，也被证实与长期获益(PFS、OS)显著相关
15、。然而，上述算法仅仅在回顾性的肺癌队列中进行了验证,其他实体瘤中能否同样有效仍需要进一步的研究。尽管如此，上述bTMB改进算法为免疫治疗标志物的探索提供了新的思路。四、bTMB检测面临的挑战目前，bTMB检测的临床应用仍面临诸多挑战。首先，bTMB的阈值如何设定？不同研究中的bTMB阈值差异较大，620mut/Mb13,33,340bTMB阈值设定的方法主要分为2种。一种以同一研究队列的tTMB阈值作为金标准来确定相匹配的bTMB阈值6,13,33,341另一种是根据免疫治疗的临床获益来确定最佳的bTMB阈值I11,17,35o这里又衍生出了一个新的问题，如何平衡获益人群的范围以及获益程度的大小？研究显示，在接受免疫治疗的NSCLC患者中，TMB越高则PFS的获益越大I11Jo在一项肺癌队列中,bTMB2lO的患者占比45%,免疫治疗取得的PFSHR为0.68;而当bTMB阈值设定为16,此时筛选出的患者减少为30%,但PFS的获益有所提高（HRO.57）36obTMB阈值设定越高，免疫治疗的获益程度可能更高，但筛选出的潜在获益人
