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1、流式细胞术培训讲座1980.1以前：1421980.11990.1:94501990.12000.1:33459.2000.12005.1:288502005.12009.4.15:29495科技文献数量增长的一个简单统计美国国立生物技术信息中心 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/PUBMED 查询：检索关键词：flow cytometry 结果：目录（一）.流式细胞术的功能特点与应用 一.流式细胞仪的功能特点 二.流式细胞术的应用（二）.流式细胞仪原理简要 一.流体动力学聚焦 二.荧光光信号检测 三.细胞分选 四.实例及数据分析 （三）.制备和设计流式样本 一.样本制备和
2、实验流程 二.设计荧光染料组合的几个注意事项 （四）.流式细胞术的新发展流式细胞术的功能特点与应用（1）流式细胞仪的定义 流式细胞仪是指，使细胞（或其他粒子）以单个方式依次通过探测光束，采集细胞被光照时产生的各种信号，然后对信号进行处理，并能对多个参数进行关联分析的一种仪器。一.流式细胞仪的功能特点（2）流式细胞仪与荧光显微镜类比荧光显微镜荧光显微镜流式细胞仪流式细胞仪视野,静止,同时单个,流动,依次肉眼/CCDPMT多激发同时多激发(激光)一.流式细胞仪的功能特点 多通道（多参数）多通道（多参数）高通量高通量高灵敏度高灵敏度定量定量高精确度高精确度细胞分选细胞分选（3）流式细胞仪的功能特点（
3、1）几个著名的实际应用：HIV感染与病程动态监测感染与病程动态监测：辅助T淋巴细胞的绝对计数；癌症动态及治疗方案癌症动态及治疗方案：细胞DNA含量和增殖活性；器官移植器官移植：交叉配型；分选人类染色体分选人类染色体，建立遗传文库（genetic libraries）；动物育种的性别选择动物育种的性别选择：分选含x或y染色体的精子；人类体外受精人类体外受精；造血干细胞和其他一大类干细胞各个分化层次鉴别造血干细胞和其他一大类干细胞各个分化层次鉴别；海洋、环境微生物研究，发现未知种属海洋、环境微生物研究，发现未知种属。二.流式细胞术的应用原子0.1nm1nm10nm100nm1m10m100m1mm
4、氨基酸蛋白质病毒支原体细菌红细胞 上皮细胞植物细胞电镜光学显微镜人眼极限当前流式细胞仪可测量颗粒大小最小约0.2m（2）测量对象：颗粒尺度 （单细胞悬浮液）（3）可测量的细胞参数 细胞膜：表面糖分子、细细胞膜：表面糖分子、细胞膜流动性和通透性、膜胞膜流动性和通透性、膜融合和翻转、膜脂质构成、融合和翻转、膜脂质构成、细胞膜及线粒体膜电位细胞膜及线粒体膜电位等等 。细胞质：（细胞质：（1 1）Ca2+Ca2+、Na+Na+、K+K+、H+H+（2 2）信）信号网络蛋白、各种抗号网络蛋白、各种抗原、各类酶分子、细原、各类酶分子、细胞骨架蛋白、荧光蛋胞骨架蛋白、荧光蛋白（白（3 3）酶活、蛋白磷）酶活
5、、蛋白磷酸化、乙酰化、甲基酸化、乙酰化、甲基化修饰等化修饰等、核酸分析：核酸分析：DNADNA、RNARNA含量，含量，DNADNA合合成、降解、断裂，成、降解、断裂，区分核酸单、双区分核酸单、双链，测量端粒长链，测量端粒长度、染色质结度、染色质结构构 、碱基构成。、碱基构成。染色单体分选染色单体分选。无需染色：大小，颗粒度，自发荧光，色素，绝对计数等无需染色：大小，颗粒度，自发荧光，色素，绝对计数等 经验性总结：细胞内几乎所有能够被荧光染料标记的成分或某种变化都可以用流式细胞仪进行检测。流式细胞仪原理简要一.流体动力学聚焦流动室流体动力学聚焦流体动力学聚焦流速：流速：10m/s10m/s最大
6、最大40m/s40m/s高通量高通量20,00020,000200,000 cell/S200,000 cell/S激光聚焦激光聚焦流体动力学聚焦的效果是，位于液流轴线上的细胞流体动力学聚焦的效果是，位于液流轴线上的细胞被依次排列成一条单细胞的队列，沿着一条极为精被依次排列成一条单细胞的队列，沿着一条极为精确而稳定的轨道运动。确而稳定的轨道运动。二.荧光检测探测光路聚焦探测光路聚焦（1）空间立体激发结构三轴垂直：高三轴垂直：高精确度精确度2%2%的的荧光差别荧光差别（2）散射光信号的产生前向散射光：大小前向散射光：大小侧向散射光：颗粒度侧向散射光：颗粒度FL-AFL-HFL-W面积（面积（A
7、A）：荧光总量）：荧光总量高度（高度（H H）：最大荧光强度）：最大荧光强度宽度（宽度（W W）：细胞直径）：细胞直径（3）PMT：光信号到电脉冲信号高灵敏度高灵敏度50MESF50MESF（4）光学镜片（5）各色荧光信号分离二色反光镜 1 2 3带通滤光片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光，荧光多通道（多参数）多通道（多参数）另一个参数：时间另一个参数：时间连续连续过程的检测过程的检测多激光激发多激光激发：多通道（多参数）：多通道（多参数）6 6杆激光，杆激光，1717个荧光通道个荧光通道八角八角反射式反射式信号收集系统信号收集系统（6）更先进的光信号收集和分离方式提高的灵敏度
8、提高的灵敏度(二色反光镜二色反光镜)反射反射透透射射:95:95%8080%二.细胞分选原理高通量高通量高纯度：可达高纯度：可达99.9%可分选极少含量的细胞可分选极少含量的细胞多种分选方式多种分选方式FACSVantage Diva的模拟四路分选。四.实例与数据分析（1）红细胞裂解后的外周血细胞检测成分：样本中的细胞有单核细胞，淋巴细胞，粒细胞染色：单克隆抗体标记 1）CD14存在于单核细胞表面。荧光染料：Phycoerythrin（PE）2）CD45以不同的密度存在于所有白细胞表面。（淋巴细胞单核细胞粒细胞）荧光染料：fluorescein isothiocyanate(FITC).信号收
9、集：FSC，SSC，PE/FITC双荧光信号。细胞数：10，000。二维图：散点图二维图：散点图CD45 FITC(log)R1=单核细胞(CD14+ve)R2=淋巴细胞(CD45单核细胞)R3=粒细胞(CD45单核细胞)CD14 PE(log)前向散射光(linear)侧向散射光(linear)CD14 PECD45 FITC细胞数细胞数CD45 FITCCD14 PE一维图：直方图一维图：直方图对比：对比：双参数的二维图双参数的二维图能提供更多信息能提供更多信息（2）DNA含量检测高精确性高精确性以及极小的以及极小的仪器误差（仪器误差（CVCV）！）！BD FASCalibur 质量控制：
10、变异系数（变异系数（CVCV）：流式细胞仪的）：流式细胞仪的“分辨率分辨率”。Tip：获取高质量数据的关键在于获得小的CV值。（3）用流式细胞仪发现的侧群细胞（SP Cell）Hoechst33258ATChromomycin A3 GC2456X89-127recip 9-221314151617Y 1820192221Ph1/313(4)染色体核型制备和设计流式样本制取单细胞悬浮液制取单细胞悬浮液荧光染色荧光染色上机检测上机检测数据分析数据分析机械破碎，酶解消化，化机械破碎，酶解消化，化学解聚学解聚去除碎步与团块去除碎步与团块细胞吸收的荧光染料与其目细胞吸收的荧光染料与其目标分子含量成正比
11、，荧光信标分子含量成正比，荧光信号强度与吸收的荧光染料分号强度与吸收的荧光染料分子成正比子成正比仪器校准和优化仪器校准和优化结合生理现象分析数结合生理现象分析数据据实验流程荧光染色设计的几个原则 了解仪器的激光了解仪器的激光/滤光片的组合滤光片的组合 匹配荧光亮度与最低密度的目标分子匹配荧光亮度与最低密度的目标分子 了解所用荧光染料的激发和发射谱了解所用荧光染料的激发和发射谱 减小荧光光谱重叠减小荧光光谱重叠 使用多杆激光，但需避免多重激发使用多杆激光，但需避免多重激发 小心使用组合染料（小心使用组合染料（tandem dyestandem dyes）设定合适的对照样本（调节荧光补偿设定合适的
12、对照样本（调节荧光补偿的样本）的样本）（1）荧光补偿发射光谱重叠带来干扰，发射光谱重叠带来干扰，需要将其进行补偿需要将其进行补偿Jerry BarnhartCD45 FITC信号“渗漏”到PE探测通道，CD4 PE信号微弱的细胞不能被区分出来CD45PercP信号不“渗漏”到PE探测通道，CD4 PE信号微弱的细胞被识别出来。Jerry Barnhart（2）了解染料光谱，合理选择组合多种荧光（3）选择多杆激光，但注意避免双重激发561nm561nm激发光可更好的激发激发光可更好的激发PEPE，但不能激发但不能激发FITCFITC，因此可避免荧，因此可避免荧光补偿。光补偿。Jerry Barn
13、hartCD19 FITCCD19 FITC22.5小时小时AmCyan+AmCyan+AmCyan-AmCyan-多重激发导致荧光信号多重激发导致荧光信号“渗漏渗漏”，降，降低分辨力低分辨力AmCyanAmCyan：紫光及蓝紫光及蓝光激发光激发FITCFITC：蓝：蓝光激发光激发Jerry Barnhart（4）使用组合染料需考虑其技术限制 PECD8 PE-Cy7CD8 PE-Cy7CD3 PE-Cy5CD3 PE-Cy50 0小时小时2 2小时小时22.522.5小时小时(Alan Stall&Ken Davis)(Alan Stall&Ken Davis)不稳定性不稳定性APC通通道假
14、阳道假阳性性无假阳无假阳性性PE通道通道假阳性假阳性PE通道通道假阳性假阳性无假阳无假阳性性APC通通道假阳道假阳性性假阳性影响假阳性影响-APC-CY7+PE-Cy7+APC-CY7-PE-Cy7（Jerry Barnhart）+APC-CY7+PE-Cy7流式细胞术的新进展一.流式细胞术法发展状况仪器技术：90年代后期，现在已相对成熟；试剂，染料：取得很大进展，目前类型已非常丰富，但商业化普及有所不足；数据分析技术：远滞后于前两者，可能成为将来流式技术最大的进步。二.新应用 数据分析技术：高内容的多参数空间要求更有效的聚类算法；k-均值聚类-混合高斯模型 特异性磷酸化蛋白多色检测试剂。胞内
15、及表面染色：如MAPK，JNK，Erk，JAK/Stat等 信号通路动力学，测绘信号网络；基本机制研究；相关疾病诊断与治疗。在当今系统生物学时代，了解蛋白相互作用的网络，多参数流式细胞仪可成为一种关键性的工具。多参数流式细胞术改变了对抗原特异性T细胞反应的认识。多维的免疫关联性只能由多参数流式细胞术揭示。量子点染料技术得到大量应用。量子点染料与传统抗体交联：高亮，发射峰狭窄，更好的染色分辨率，更大的实验设计空间。Beckman-Coulter的新流式细胞仪-2009年下半年。谢 谢 BD FACSCalibur BD FACSAria II BD FACSVantage DivaBeckMan
16、-Coulter MoFlo XDP BeckMan-Coulter MoFlo XDP BD Influx-7激光高速分选声学耦合喷嘴声学耦合喷嘴二维位置分选二维位置分选lasermirrorCCD camerapinhole mirrormonochromatorM plan APO 20 x光谱扫描光谱扫描Moflo Astrios-7激光49色通道Quick ReleaseNozzleSort ChamberElectronicsPrecision Optical Device(POD)Laser EnginesPressure ConsoleModular Laser Palette355 nm True UV(100 mW)Up to 6 fiber coupled lasers+1 free-space UV355 nm True UV(100 mW)640 nm(60 mW)592 nm(200 mW)561 nm(200 mW)532 nm(150 mW)488 nm(100 mW)405 nm(50 mW)Dr.Ger van den Engh Moflo&Infl
