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1、中国实验动物学会团体标准实验动物绿脓杆菌RPA检测方法编制说明中国实验动物学会团体标准实验动物绿脓杆菌RPA检测方法编制说明（一）工作简况，包括任务来源、协作单位本标准由中国实验动物学会提出，中国实验动物学会实验动物标准化技术委员会归口,根据中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会（以下简称专委会）有关文件及GB/T16733国家标准制定程序的阶段划分及代码和采用快速程序制定国家标准的管理规定的要求，结合实验动物专业具体情况，特制定本标准。由吉林大学、南方医科大学、中国医学科学院医学实验动物研究所、中国食品药品检定研究院按照中国实验动物学会团体标准编写规范编制起草。（二）主要工作过程、标准主要
2、起草人及其所做的工作等；2022年3月，召开了本课题启动会和第一次研讨会。课题负责人就课题目标、研究内容、技术路线、工作进度、课题管理、经费使用、知识产权等几个方面提出了工作设想，并对课题的研究任务做了具体分工。2022年3月，完成了对收集到的国内外相关标准及相关资料数据的整理、分析，对已经建立的实验动物绿脓杆菌RPA检测方法数据进行整理并对方法进行验证。起草小组制定了标准初稿，发送国内实验动物学专家、有关重要企事业单位，公开征求意见。2022年4月，起草小组针对专家提出的关于格式、关键内容、技术指标、附录问题意见和建议对标准草案进行了修订。并向全国实验动物标准化技术委员会提交了实验动物标准制
3、订计划项目提案表和团标草案。2022年10月，收到全国实验动物标准化技术委员立项通知，按照标委会团标撰写要求，对团标草案进行了进一步修订，并面向省内外实验动物相关企事业单位公开征求意见。2022年11月，起草小组委托三家实验动物研究机构对标准中所制定的方法进行验证。2022年12月，起草小组整理汇总专家对本标准征求意见稿提出的问题，同时对标准格式进行了规范，最终形成标准送审稿、编制说明，实验验证报告等材料，送交中国实验动物学会实验动物标准化委员会秘书处。本标准由吉林大学、南方医科大学、中国医学科学院医学实验动物研究所、中国食品药品检定研究院共同起草，起草人为高飞、朱玉峰、袁宝、张西臣、张楠、向
4、志光、苏磊、付瑞。高飞、袁宝负责组织协调，统筹分工；高飞、朱玉峰负责检测方法建立和标准撰写；张楠负责方法验证；张西臣负责编制说明撰写；向志光责查阅文献、征求意见；苏磊，付瑞负责修订。（三）标准编写背景；绿脓杆菌广泛存在于实验动物皮肤和肠道、设施环境、饲料饮水中，是实验动物常见的一种条件性致病菌，同时该菌也是SPF级实验动物必须排除的病原菌之一。近几年实验动物质量检测结果显示，绿脓杆菌阳性时有发生，其污染来源广泛，尤其在夏季易发，多省市实验动物生产单位发生该菌的污染事故，严重影响我国SPF级实验动物质量。目前，我国实验动物微生物等级及监测标准GB/T14926.17-2001对绿脓杆菌采用的是传
5、统的分离培养和生化鉴定方法进行检测，此方法费时费力，而且对实验操作人员的专业素质要求较高。因此，亟需找出更适用于实验动物绿脓杆菌的准确、快速的鉴定方法。RPA技术作为一个新兴的分子检测技术已经在医学、农学、公共卫生等方面得到广泛的应用，同时在实验动物质量检测方面的应用也逐渐得到重视。与传统检测方法相比，RPA技术具有准确、快速、易操作等优点，是对实验动物微生物检测大规模摸底初筛的良好方法。能够为高校和研究机构等实验动物使用单位在大规模实验动物日常监测、感染早期诊断、生物净化快速检测绿脓杆菌提供技术支撑；同时，能够为实验动物质量检测机构快速筛查提供新的方法。本项目由吉林大学、南方医科大学、中国医
6、学科学院医学实验动物研究所、中国食品药品检定研究院承担并完成。建立了实验动物绿脓杆菌RPA检测方法，并通过收集、整理、汇总国内外有关资料，参照GB14922.22011实验动物微生物学等级及监测、GB19489实验室生物安全通用要求，按照中国实验动物学会团体标准编写规范的要求进行标准的编制起草。（四）标准编制原则；所采用的相关数据经过严谨的科学论证；引用的标准现行有效，适用于本标准相关内容的确定；充分吸收借鉴实验动物领域相关国家和地方标准，尤其近几年新颁布的实验动物地方标准、行业标准、团体标准等；结合我国实验动物的质量及使用情况选择发病率高、危害严重的病原体建立适用的检测方法制定标准,满足行业
7、对实验动物的质量需求；检测方法具有可操作性和推广价值。（五）确定标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则等）的论据（包括试验、统计数据），修订标准时，应增列新旧标准水平的对比；1、范围：本文件规定了实验动物绿脓杆菌RPA的检测方法。本文件适用于小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠和兔绿脓杆菌的检测；实验动物怀疑本病发生；实验动物接种物；实验动物环境和动物源性生物制品中绿脓杆菌的检测。2、主要技术内容：引物：参照GenBank中K01397.1序列设计并合成引物（见表1）,引物用无RNaSe去离子水配制成10molL储存液，-20C保存。表1引物序列引物序列（5,3O片段大小PEA-
8、RPA-FPEA-RPA-RTgctgcactactccatggtcCgtggatgaacaccttgatg23Ibp样本制备：病灶组织：在麻醉或动物安乐死后，通过无菌操作采集动物的病灶组织2.0g置于5mL无菌离心管，加入4mL无菌PBS,使用电动匀浆器充分匀浆l2min,12O（X）r/min离心IOmin,取上清液移入另一支5mL无菌离心管中，编号备用。肛拭子、粪便、分泌物或盲肠内容物：采集肛拭子、粪便、分泌物或动物安乐死后采集盲肠内容物，取肛拭子或2.0g待检样品置于5mL无菌离心管，加入4mL无菌PBS,使用电动匀浆器充分匀浆l2min,12000r/min离心IOmin,取上清液移
9、入另一支5mL无菌离心管中，编号备用。绿脓杆菌的分离培养物：经选择性培养基培养的固体菌落或液体培养物，或待鉴定的纯化培养物，取适量样本装入1.5mL无菌离心管中，编号备用。实验动物饲料、垫料和饮用水：取适量的实验动物饲料、垫料分别置于聚乙烯薄膜袋中，加入适量的无菌PBS,使饲料和垫料全部浸泡在PBS液体中。密封浸泡510min后充分混匀，将混悬液转移至15mL离心管中，静置30min,取上清液移入到另一支5mL无菌离心管中，编号备用。取适量实验动物的饮用水直接转移到5mL无菌离心管中，编号备用。实验动物设施设备：用无菌棉拭子采拭实验动物设施设备出风口初效滤膜表面沉积物，将拭子置入15mL无菌离
10、心管，加入适量无菌PBS,浸泡510min后充分混匀，取出棉拭子后将离心管静置30min,将上清移入另一支5mL无菌离心管中，编号备用。样品DNA提取:利用商品化的细菌DNA提取试剂盒进行样本DNA的提取,提取方法按照选用试剂盒配套的说明书进行。测定样本DNA浓度后进入下一步骤或放入80。C保存备用。RPA扩增反应体系：RPA扩增反应体系见表2。反应液的配制在冰上进行操作，每次反应同时设计阳性对照、阴性对照和空白对照，其中以绿脓杆菌DNA作为阳性对照、以不含有绿脓杆菌的其它细菌DNA作为阴性对照、以不加入DNA模板而用DEPC水代替模板作为空白对照。表2RPA扩增反应体系试剂剂量Rehydra
11、tionbuffer29.5L样品DNA2.0LPEA-RPA-F2.4LPEA-RPA-R2.4LDEPC水11.2LMgAc2.5L总体系50.0L将反应体系置于3740。C水浴锅中。反应时间为25min30min0电泳观察：将适量50XTAE稀释成IXTAE溶液，配制成含有溟化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶。用移液器取10L的RPA产物加入1.5%琼脂糖凝胶的梳孔中，其它孔中分别加入等量的空白对照、阴性对照、阳性对照物，并以MarkerDL200ObP作为参照进行电泳检测。电压根据实际电泳槽长度确定，一般控制在35Vcm,当看到指示染料移动到凝胶边缘时关闭电源结束电泳。将凝胶放入凝胶成像系统进
12、行拍照记录电泳结果。结果描述与判定：阳性结果：当阳性对照与检测样品同时出现目的条带，且阴性对照和空白对照未出现条带时，判为核酸阳性。阴性结果：当阳性对照出现目的条带，检测样品、阴性对照和空白对照均未出现条带时，判为核酸阴性。序列测定：必要时，可取待检样品扩增出的阳性RPA产物进行核酸序列测定,序列结果与已公开发表的绿脓杆菌特异性片段序列进行比对。序列同源性在90%以上，可判定待检样品绿脓杆菌核酸阳性；否则判定绿脓杆菌核酸阴性。（六）主要试验（或验证）的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果；实验动物绿脓杆菌的传统分离培养检测方法虽然结果可靠性强，但操作繁琐且耗时较长，RPA技术能够有效的
13、减少反应时间，缩短检测周期，并且操作简单、特异性强，能够排除人为干扰、交叉污染等不可控因素对目标细菌的影响；该方法对仪器设备要求低、不需要大型的仪器设备，适合于实验室对这两种细菌的大规模摸底初检；同时，也为实验动物所携带微生物的鉴定和检测提供了一个新的技术方法。本所建立实验动物绿脓杆菌RPA检测方法，适用于小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠和兔绿脓杆菌的检测；实验动物怀疑本病发生；实验动物接种物；实验动物环境和动物源性生物制品中绿脓杆菌的检测。该方法能快速、准确的鉴别出实验动物样品是否携带绿脓杆菌。在后期工作中将进一步扩大检测样本量验证该方法的准确性和实用性，并在多家实验动物质量检测机构进行推广应用，从而
14、提高绿脓杆菌在实验动物质量监测中的筛查效率。我们邀请吉林省实验动物质量检测中心；东北农业大学动物科学学院；吉林农业大学动物医学学院三家单位对该方法进行了验证试验，结果证实所建立的实验动物绿脓杆菌RPA检测方法具有快速、特异、灵敏，操作简单的特点，在实验动物绿脓杆菌检测方面具有良好应用前景。鉴于实验动物在生物医药产业的广泛应用，该方法的推广或将带来显著的经济效益。（七）采用国际标准和国外先进标准的程度，以及与国际、国外同类标准水平的对比情况，或与测试的国外样品、样机的有关数据对比情况；目前没有相应的国际标准。（八）与有关的现行法律、法规和强制性标准的关系；本标准的编制依据为现行的法律、法规和国家标准，与这些文件中的规定相一致。目前实验动物国标中没有绿脓杆菌RPA检测方法的操作规范。（九）重大分歧意见的处理经过和依据；从标准结构框架和制定原则的确定、标准的引用、有关技术指标和参数的试验验证、主要条款的确定直到标准草稿征求专家意见（通过函寄和会议形式多次咨询和研讨），均未出现重大意见分歧的情况。（+）标准作为强制性标准或推荐性标准的建议；作为推荐性标准（十一）贯彻标准的要求和措施建议（包括组织措施、技术措施、过渡办法等内容）；建议由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会组织本标准的宣传、推广和实施监督。（十二）废止现行有关标准的建议；无（十三）其他应予说明的事项。
