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1、2023水通道蛋白3在小鼠早期胚胎发育过程中的表达摘要目的了解水通道蛋白3(aquaporin3,AQP3)在小鼠早期胚胎发育中的表达分布情况。方法建立昆明小鼠控制性超排卵模型,收集小鼠四细胞期、八细胞期、桑意期胚胎及早期囊胚,采用免疫荧光显微镜和激光共聚焦显微镜对AQP3在小鼠早期胚胎中的表达模式及亚细胞定位进行检测分析。结果在小鼠早期胚胎的4个时期中均能检测到特异性AQP3荧光信号,激光共聚焦显微镜观察到AQP3的分布部位在各时期不完全相同在四细胞期胚胎及八细胞期胚胎主要定位于卵裂球核膜,桑意期胚胎主要定位于细胞膜,而早期囊胚主要定位于滋养层细胞膜及细胞质。结论AQP3对小鼠早期胚胎的发育
2、可能具有潜在的调控作用。【关键词】水通道蛋白质3;胚胎发育;显微镜检查,荧光;小鼠液体转运是生殖过程中不可或缺的重要环节。水通道蛋白Qquaporin,AQP)是存在于细胞膜上介导高效水转运的一类蛋白,在维持机体内环境的动态平衡中发挥重要作用。迄今发现的哺乳动物AQP家族已有13种(AQPo12)1,广泛分布于机体各组织的细胞中。根据AQP的功能可将其分为3类2。第1类是专一性水通道蛋白,包括AQP0、1、2、4、5、6、8;第2类是甘油水通道蛋白,除了介导自由水跨膜转运以外,还可以介导一些线性小分子物质,如甘油、尿素、羟基化合物等的转运,包括AQP3、7、9、10;第3类的功能还未研究清楚,
3、包括AQPl1、12。文献报道有11种水通道蛋白(AQPO10)在睾丸、精子、卵泡、子宫、胚胎、胎盘、胎膜等组织高表达,参与哺乳动物的生殖过程。既往研究显示,AQP3mRNA及AQP7mRNA高表达于哺乳动物各发育时期的早期胚胎,提示AQP3及AQP7在动物早期胚胎的发育过程中具有一定作用5-7。本研究通过检测甘油水通道蛋白中的AQP3在小鼠早期胚胎各发育时期的表达和分布情况,为研究AQP3在小鼠早期胚胎发育过程中的作用及其分子机制提供相关基础信息,从而进一步完善生殖生理学中早期胚胎的发育机制。材料与方法一、小鼠早期胚胎的收集与处理无特定病原体(SPeCifiCpathogenfree,SPF
4、)级58周龄昆明小鼠共120只伶格证编号0082669、0086020s0088531),体重2530g,饲养于广州医学院实验动物研究中心SPF级动物实验室。雄鼠单笼饲养,雌鼠集中饲养,按照国际SPF级动物饲养标准管理。参照文献8方法建立控制性超排卵小鼠模型。对动情前期雌鼠于当天16:30腹腔注射孕马血清促性腺激素（宁波第二制药厂）510IU/只,4648h后注射入绒毛膜促性腺激素（丽珠制药）1OIU/只,然后将雌鼠与雄鼠以1：1合笼。合笼次日清晨检到黄白色阴道栓者记为受孕。于人绒毛膜促性腺激素注射后60、68、80、90h时分别取56只孕鼠以脱颈椎法处死,取出输卵管及子宫,在解剖镜下用磷酸盐
5、缓冲液（PhOSPhatebUfferedSaline,PBS）冲出胚胎后转移至立体显微镜。分别收集四细胞期、八细胞期、桑篡胚期胚胎及早期囊胚置于培养液（G-1,瑞典VitrOlife公司）中待用。二、免疫荧光染色将光镜下形态正常的各时期胚胎按以下步骤行免疫荧光染色：4%多聚甲醛室温固定3060min;含0.1%聚乙二醇辛基苯基酸（TritOnX-IoO）的PBS中渗透30min;PBS洗涤3次,山羊血清封闭液中封闭1h;与特异性AQP3抗体（1：250,美国SantaCrUZ公司）于4。C冰箱孵育过夜;复温Ih后与二抗（1：64,武汉博士德公司）于室温下共孵育1h0l的4,6-二眯基-2-苯
6、基明|口朵（4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）溶液中核染色20min;PBS洗涤,抗荧光淬灭封片剂（上海碧云天公司）封片,盖上1张盖玻片。小心按压玻片,使胚胎稍受压但不至破碎。在倒置荧光显微镜（德国Leica公司,DM1R13）或激光共聚焦显微镜（德国Zeiss公司,LSM710）下观察特异性AQP3荧光信号。阴性对照以PBS代替一抗。所有步骤均在立体倒置显微镜下操作。重复3次,每次检测各发育时期胚胎2025枚。一、免疫荧光显微镜检测结果显示,小鼠四细胞期、八细胞期、桑甚期胚胎及早期囊胚均可检测到特异性AQP3的阳性信号,阴性对照均未检测到荧光信号。二、激光共
7、聚焦显微镜扫描扫描发现,四细胞期及八细胞期胚胎的特异性AQP3荧光信号均分布在卵裂球的细胞质、核膜处,其中均以核膜处的荧光信号较强;桑意期胚胎的AQP3荧光信号主要分布在各卵裂球的胞膜及各卵裂球连接处;早期囊胚则主要分布滋养层细胞的细胞质及细胞膜中,囊胚腔中也可见荧光信号。讨论AQP在哺乳动物中的分布极为广泛,对维持机体器官的液体平衡具有不可替代的作用。已有研究证明,AQP在肾脏尿浓缩机制、唾液腺分泌、脑脊液产生、脑水肿、视听障碍、角膜炎、肺炎、羊水紊乱等生理与病理过程中发挥重要作用9。近年研究显示,AQP还参与哺乳动物配子的发生、早期胚胎的形成及发育、胚胎着床、胎盘发生及妊娠维持等,这表明A
8、QP在哺乳动物的生殖过程中也扮演了重要角色4。Edashige等8曾对美国癌症研究所(InStitUteOfCanCerReSearCh,ICR)小鼠卵母细胞、四细胞期胚胎、桑意期胚胎、囊胚进行AQP19mRNA的相对定量分析,发现AQP3mRNA及AQP7mRNA在这4个时期均高表达AQP8mRNA与AQP9mRNA仅表达于囊胚期。之后一些相似的研究6-7与Edashige等的结果存在一定的差异,但一致之处为AQP3mRNA与AQP7mRNA在小鼠早期胚胎各阶段均有高表达、AQP8mRNA在囊胚期有高表达提示AQP3、7、8在早期胚胎形成过程中发挥作用。EdaShige等10还检测了ICR小
9、鼠的卵母细胞及桑意期胚胎中AQP3和AQP7的表达定位,发现AQP3和AQP7均未表达于卵母细胞,AQP3明显表达于桑意期胚胎表面,AQP7微弱表达于桑意期胚胎表面。BarCr。代等11对CD1小鼠卵母细胞、二细胞期、八细胞期、桑意期胚胎及囊胚AQP3、8、9的表达进行定位,发现AQP3明显表达于二细胞期、/8田胞期胚胎的细胞质,在致密桑意期胚胎中表达于所有卵裂球的细胞膜,在囊胚分布于内细胞团及滋养层细胞基底部;AQP8直到八细胞期才有表达并定位于细胞质,致密桑意期胚胎中表达于细胞连接处,在囊胚仅表达于滋养层细胞的基底部;AQP9也从八细胞期开始检测到有表达并定位于细胞连接处,桑意期胚胎中表达
10、于卵裂球外部及细胞质处,囊胚期表达于内细胞团细胞质及滋养层细胞膜的顶膜处。本研究检测昆明小鼠早期发育过程中AQP3的表达及定位情况,免疫荧光显微镜结果显示AQP3在昆明小鼠四细胞期、八细胞期、桑意期胚胎及早期囊胚中均有明显表达。激光共聚焦显微镜扫描定位结果显示,四细胞期胚胎及八细胞期胚胎的特异性AQP3荧光均质分布于所有卵裂球的细胞质、核膜处,其中均以核膜处的荧光信号较强;桑意期胚胎特异性AQP3荧光较均质分布在各卵裂球的细胞膜处,以卵裂球连接处较为明显;早期囊胚的AQP3荧光信号主要分布于滋养层细胞的细胞膜及细胞质处囊胚腔也可见荧光。这些结果与BarCroft等11的研究结果稍有不同。本研究
11、显示,小鼠八细胞期胚胎AQP3主要表达于卵裂球的核膜而非细胞质,推测是由于动物种属不同所致。另外,本研究中所检测的囊胚未发育至扩张期,故未检测到明显的内细胞团。从本研究结果可见,AQP3在小鼠早期胚胎各时期均有表达才是示其参与早期胚胎的发育过程;其在各时期的表达部位并不完全相同提示在各时期发挥的作用或作用的方式可能有所不同。胚胎四细胞期与，闻胞期,AQP3主要表达于核膜,其次表达于细胞质提示AQP3可能主要参与卵裂期胚胎的细胞核分裂,以及细胞质中的超微结构,如线粒体、高尔基体等各种细胞器的液体转运,以维持胚胎内部渗透压的平衡;桑意期胚胎主要表达于各卵裂球的细胞膜,说明此时AQP3可能主要参与卵
12、裂球的融合,以及囊胚腔的形成;而在早期囊胚期主要表达于滋养层细胞的细胞质与细胞膜中,囊胚腔内也可见表达,提示AQP3参与早期囊胚的继续分化,并可能在囊胚着床期滋养层细胞的定位、黏附、穿透等过程中发挥作用。总之,本研究应用免疫荧光显微镜结合激光共聚焦显微镜研究AQP3在小鼠早期胚胎各发育时期的表达及亚细胞定位情况,结果显示,AQP3参与小鼠早期胚胎的生长发育,且其作用部位和方式可随各时期的发育需要而发生相应的调节提示AQP3对小鼠早期胚胎的发育过程具有潜在的调控作用,还可能在囊胚的着床中发挥协助作用。下一步将深入研究AQP3在动物早期胚胎的发育及着床过程中的具体作用及分子机制,进而拓展研究AQP各亚型在哺乳动物早期胚胎形成、发育等过程中的作用,从而完善生命科学基础理论,并为相关疾病寻找潜在治疗靶点。
