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1、2024基于液相色谱同位素稀释质谱法测定氨基酸的蛋白质定量方法前言为定量分析蛋白质建立蛋白质水解液中氨基酸的液相色谱-同位素稀释质谱分析方法。蛋白质在6mol/L盐酸溶液存在下130。C水解经Hypercarb多孔石墨碳色谱柱、0.1%全氟戊酸水溶液/乙睛流动相体系分离，选择脯氨酸、缀氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸5种较为稳定的氨基酸，以其相应的稳定同位素标记物为内标括号法定量，结合蛋白质的氨基酸序列信息实现对蛋白质的绝对定量。结果表明，5种氨基酸在101000ng/mL范围内线性关系良好(R20.995),检出限和定量限分别在0.020.07ng/mL和0.060.2ng/mL之间，3个不
2、同质量水平下经水解处理的回收率在97.0%102.4%之间、相对标准偏差在1.1%3.0%之间。对新型冠状病毒(新冠病毒)N蛋白人源IgG单克隆抗体有证标准物质的分析结果和新冠病毒N蛋白国家计量比对的测量结果满意,证明该方法具有足够的准确度。蛋白质是生命体实现生理功能的直接参与者,因此研究生命体蛋白质表达模式和功能作用不仅局限于蛋白质的定性分析,临床检测、食品分析等领域对蛋白质的定量测量需求越来越强烈。常用的蛋白质定量测量方法主要有电泳法、免疫法、高效液相色谱和液相色谱-质谱联用法等,随着质谱分析技术的发展,被认为是小分子定量金标准的同位素稀释质谱法应用于蛋白质定量测量中,展现了准确、精密、易
3、于溯源等特点。基于同位素稀释质谱法的蛋白质定量技术,可以将蛋白质酶解成肽段后测定特征肽段进行定量,也可以将蛋白质完全水解成游离氨基酸后,测定各氨基酸含量,再根据蛋白质的氨基酸序列信息、,由氨基酸含量计算得到蛋白质含量。基于肽段的定量方法具有更好的特异性,但需要设计酶解方案、合成标记的特征肽段,难以建立具有普适性的定量方法;基于氨基酸的定量方法,不仅需要获得准确的氨基酸序列信息,而且为了避免游离氨基酸和杂质蛋白、肽段水解产生氨基酸对测量结果的干扰,需要预先提纯蛋白质,但该方法易于建立测量结果的计量溯源性,实现对蛋白质的绝对定量,且可以建立适用于不同蛋白质的样品处理和仪器分析方法,和传统氨基酸分析
4、法相比操作简单、准确度和精密度高,和基于肽段的定量方法相比通用性更强,因此应用于蛋白质含量测定国际比对、蛋白质标准物质研制和临床诊断中各种蛋白质分析的校准,建立蛋白质分析的计量溯源性。本研究采用蛋白质水解后以同位素稀释质谱法测定氨基酸含量的方式,建立可用于多种蛋白质的高准确度定量方法,方法精密、灵敏,结果可溯源至国际基本单位,可应用于蛋白质绝对定量和蛋白质标准物质研制。1实验部分1.1仪器与试剂超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪:ACqUityUPLCI-ClassPlus/XEVOTQ-XS型,美国Waters公司;电子天平:XPEIO5型湍士MettlerToledo公司;超纯水仪:Mi
5、lli-Q型德国Merck公司;水燃料氢氧机QH200型湖南沃克能源科技有限公司;强制对流烘箱:FDll5型德国Binder公司;冷冻干燥机:L-200型,瑞士Buchi公司。GBW(E)100084脯氨酸纯度标准物质(Pro,99.01.5%,k=2)、GBWo9236L-缴氨酸纯度标准物质(Val,99.4%,Ur=0.6%,k=2)GBWo9237L-亮氨酸纯度标准物质(LeU,99.7%,Ur=O.4%,k=2)、GBWO9238L-异亮氨酸纯度标准物质Qle,99.7%,Ur=0.3%,k=2)、GBW(E)100061苯丙氨酸纯度标准物质(Phe,99.01.5,k=2)等20种天
6、然氨基酸纯度标准物质和GBW(E)091110新型冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白)人源IgG单克隆抗体溶液标准物质(85.38.5gg):中国计量科学研究院;PrO-13C5、Vai-13C5eu-13C615N、Ile-13C6、Phe-13C9:纯度98%,丰度99atom%,美国CIL公司;甲酸、乙睛:质谱纯德国MerCk公司;全氟戊酸:纯度97%,德国Merck公司。1.2标准溶液的配制1.2.1氨基酸标准储备液为了获得更高准确度的定量结果,采用重量法配制标准溶液。分别称取Pro、Val、LeikiaPhe标准物质约10mg至不同的10mL容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,称量并记录溶液总重
7、彳导浓度约为IoOOgg的氨基酸标准储备液。12.2氨基酸混合标准中间液分别称取Pr。、VaiLeu、lie、Phe储备液适量至IOmL容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,称量并记录溶液总重,得氨基酸混合标准中间液。1.2.3内标物标准储备液分别称取PrO-13C5、VaI-13C5、LeU-13C615NJle-13C6,Phe-13C9Iomg至不同的IOmL容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,称量并记录溶液总重彳导浓度约为1000gg的内标物标准储备液。1.2.4内标物混合标准中间液分别称取Pro-13C5,VaM3C5.1.eu-13C615NJIe-13C6,Phe-13C9储备液适量至10
8、mL容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,称量并记录溶液总重彳导内标物混合标准中间液J2.5标准工作液分别移取氨基酸混合标准中间液、内标物混合标准中间液9L10L至样品瓶中并准确称重,冷冻干燥至干后用0.1%甲酸水溶液500L复溶,得低浓度标准工作液。分别移取氨基酸混合标准中间液、内标物混合标准中间液11LJOL至样品瓶中并准确称重,冷冻干燥至干后用0.1%甲酸水溶液500L复溶彳导高浓度标准工作液。13仪器分析条件色谱条件Hypercarb多孔石墨碳色谱柱(100X2.1mm,3m);柱温40。C流动相:A为0.1%(体积分数,下同)全氟戊酸水溶液,B相为乙睛;梯度洗脱:05min使流动相A由10
9、0%降至90%,510min使流动相A由90%降至0%后保持至11.5min,再将流动相恢复至初始比例平衡1.5min;流速O3mLmin;进样量2L01.3.2质谱条件电喷雾正离子源(ESI+),毛细管电压3.0kV,离子源温度,150,脱溶剂气流速1OOoLh,脱溶剂气温度500,锥孔气流速150Lh,碰撞气为氨气多反应监测(MRM)模式。其他质谱条件列于表1,其中*为定量离子。表1尿基酸分析质谱参数导出到EXCELTable1MSparametersforaminoacids氨基酸特征离子对m/z锥孔电压/V碰撞能力/eV迪基酸特征离子对m/z椎孔电压/V碰搔能力/eV脯氨酸11670,
10、1164310101225膈氨酸Res121741012缀氨酸11872,1185515151016缀氨酸les123761510亮氨酸13286,1324410101018JKKK-13Ce15N139921510异亮氨酸13286,1326910101016异亮氨酸NCe138911010苯丙氨酸16612016610320201226苯丙氨酸J3Cg17512820121.4蛋白质的水解准确称取适量样品至清洗干净的2mL棕色安甑瓶,再移入内标物混合标准中间液10L并准确称重,加入6molL的盐酸水溶液600L,通氮气1min后融封,在130。C烘箱中水解15h。水解后冷冻干燥至干,用0.
11、1%甲酸水溶液500L复溶进LC-MS/MS分析。1.5蛋白质含量计算采用括号法测定各氨基酸含量,即以低浓度标准工作液-样品-高浓度标准工作液-样品-低浓度标准工作液进样测试,按公式（1）分别由各氨基酸含量计算蛋白质含量：=（E-空）+空CyrDmgMNmenMk（）式中,Cx为由某氨基酸计算得到的蛋白质浓度,pg/g;Rs、RI、Rh分别为样品、低浓度和高浓度标准工作液中氨基酸和内标物的峰面积比;mSTDI、mil和mSTDh、mlh分别为低浓度和高浓度标准工作液配制时加入氨基酸混合标准中间液、内标物混合标准中间液的质量,mg;CSTD为混合标准中间液某氨基酸的浓度,pg/g；mSI为蛋白质
12、水解前加入内标物混合标准中间液的质量,mg;ms为样品质量,mg;n为蛋白质中某氨基酸的数量;MAA、MN分别为某氨基酸、蛋白质的摩尔质量,g/mol。各氨基酸含量计算得到的蛋白质量分数结果,经正态性检验、一致性和等精度检验后的算术平均值或加权算数平均值即为蛋白质含量结果。2结果与讨论2.1 质谱条件优化用0.1%甲酸水溶液分别配制浓度为100ngmL的20种天然氨基酸标准溶液和内标溶液,以连续流直接进样的方式注入质谱仪中进行全扫描,以响应最高的准分子离子峰质荷比作为母离子,优化锥孔电压等各质谱参数使母离子信号强度最高。再对母离子分别进行子离子扫描,选择信号强度最高且稳定的离子对作为定量离子对
13、和定性离子对,优化碰撞能量使子离子信号强度最高。优选的质谱条件和特征离子对列于表1。2.2 色谱条件优化由于氨基酸极性较强,C18色谱柱上不易保留,分离效果不佳,常通过柱前衍生降低极性或者使用亲水作用(HiliC)色谱柱改善分离，但分析效率和分离效果难以满足蛋白质定量分析的要求。本研究结合多孔石墨化碳填料(HyPerCarb)和挥发性离子对试剂,高效准确、精密的实现了20种天然氨基酸的分离分析(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缴氨酸),除His、Arg、
14、TrP外绝大多数氨基酸峰型对称、尖锐,质谱响应灵敏。2.3定量氨基酸选择由单一氨基酸含量计算蛋白质含量结果,因受蛋白质纯度、水解过程、测量误差等众多因素影响,难以保证准确度。而由多个氨基酸含量统计计算的蛋白质含量,可以降低杂蛋白、氨基酸水解差异和偶然因素引入的误差,获得更为准确的蛋白质定量结果。但实验表明,经过1.4节的水解步骤后,Ser、Thr、Cys、Asn、Gin、Glu、Met.TyrTrp等氨基酸会发生不同程度的降解。因此综合考虑各天然氨基酸的耐酸性、热稳定性和所建立定量分析条件下的准确性、精密度,结合蛋白质中氨基酸的含量差异,选择Pro.Val、LeuJMPhe作为定量蛋白质的氨基
15、酸。2.4水解条件优化水解条件优化结果示于图1。水解需要在保证氨基酸未被降解的前提下尽可能将蛋白质完全转化成游离氨基酸,而水解效率受水解试剂和浓度、水解温度、水解时间等因素影响,因此,本研究使用肌红蛋白(Mb)、人血清白蛋白(HSA)和C-反应蛋白(CRP)优化水解条件。回出云星国沙 妥,*三衰宾堡罅割ysMm在步 定博%耳箜比集博盛茶HL Lo.o.o.o.o.捻酸浓度/（moH,T）水解温度/C水解时间/ha盐酸浓度；b水解温度；c水解时间图1水解条件优化蛋白质水解方法主要有酸水解、碱水解、酶水解和微波消解等,碱水解容易使部分氨基酸消旋化,酶水解往往需要较长的时间,酸水解通用、高效的特点使其成为采用较多的水解方法。酸水解最常用的水解试剂是盐酸和甲磺酸,因为甲磺酸难易挥发,水解后难以去除,会干扰质谱检测,因此选择盐酸作为水解试剂。通过对不同浓度的盐酸考察表明,浓度小于4molL水解效率不足,浓度大于6molL水解后氨基酸含量基本一致（图1a）;通过对不同水解温度的考察表明,高于100。C的水解温度可以显著提升水解效率,130。C和150。C水解后氨基酸含量没有显著差异（图2a）;通过对水解时间的考察表明,3种蛋白质水解15h后氨基酸含量没有显著增加
